李 兵 李 宵 馬雪亮 李 研 白曉鑫張洪峰 李愛軍 李廷貴 劉 寧 王 鑫

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

隨著高血壓、高血脂等基礎(chǔ)疾病發(fā)病率的提高，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）以及由其所引發(fā)的急性心肌梗死（AMI）發(fā)病率逐年升高，嚴重危害著人類的生命健康。及時通過藥物或介入手術(shù)溶栓以實現(xiàn)血流恢復灌注是目前臨床上治療AMI的主要方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥的存在嚴重影響著AMI預后。因此，以抑制缺血再灌注損傷為靶點，或許是提高AMI治療效果的有效途徑。中藥丹參始載于《神龍本草經(jīng)》，味苦、微寒，具有活血通絡(luò)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩之功效，廣泛應用于心血管系統(tǒng)疾病的治療［1］。丹參多酚酸鹽是丹參的主要活性成分之一，王強等［2］研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽具有降低氧化應激損傷、抑制細胞凋亡的作用，但丹參多酚酸鹽是否對心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護作用尚未見文獻報道。本實驗于2017年4月至2017年5月進行，采用Langendorff灌流系統(tǒng)建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，研究丹參多酚酸鹽對離體心臟的保護作用并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用健康清潔級SD大鼠，雄性，鼠齡8周齡，220～260 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。 飼養(yǎng)環(huán)境：23～25 ℃、相對濕度55%～60%，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，規(guī)格：50 mg/瓶，批號：1603014）；維拉帕米注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：43161209）；TTC（美國 Sigma公司，批號：M2128）；HE 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：161209）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：170112014、161007013、161210007）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、Na+-ATP、Ca2+-ATP 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：170218、161125、160908、170107、160714、160906）；K-H 液：用 NaCl 20.67 g、NaHCO 36.27 g、KCl 1.05 g、KH2PO40.48 g、葡萄糖 5.99 g、MgSO4·7H2O 0.87 g、CaCl20.85 g 溶解于1 L 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH=7.40（自制）。 2）儀器：Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)（美國Radnoti公司）；Medlab/8C生物信號采集系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）；BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；石蠟切片機（德國Leica公司）；紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；組織勻漿機（上海洽姆儀器科技有限公司）；生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 分組與給藥 將120只實驗用大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組、模型組、丹參多酚酸鹽低、中、高（10、20、40 mg/kg）劑量組和維拉帕米組（2.5 mg/kg），每組20只。手術(shù)前2 h，丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組和維拉帕米組分別腹腔注射相應藥物，正常對照組和模型組均給予生理鹽水。

1.4 模型制備 參照郭麗麗等［3］報道的實驗方法制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型：腹腔注射20%烏拉坦實施麻醉后，迅速開胸，切斷主動脈后取出心臟，置預冷（4℃）K-H液中，分離主動脈，釆用Langendorff法逆灌含氧K-H液（充以95%O2+5%CO2），切開左心耳并由此置入帶測壓導管的球囊，測壓導管連接生物信號采集系統(tǒng)。正常對照組持續(xù)以7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）110 min，模型組和丹參多酚酸低、中、高劑量組依次行7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37 ℃）20 min、停灌 30 min后恢復灌注 60 min，然后取材行各指標檢測。

1.5 標本采集與檢測 1）心肌酶活性檢測。分別取各組大鼠心臟冠脈流出液，采用生化分析法檢測心肌酶GOT、LDH、CK-MB活性。2）心臟組織梗死面積及心臟組織病變檢測。每組隨機選取6只大鼠離體心臟，-20℃凍存20 min，置于2%TTC溶液恒溫（37℃）、避光孵育15 min，紅色為正常組織、灰白色為梗死區(qū)，通過醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計算梗死面積百分率。每組另隨機取6只大鼠離體心臟，置4%多聚甲醛溶液固定72 h，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，按照染色試劑盒操作步驟行HE染色，然后通過倒置光學顯微鏡觀察心臟組織病變。3）血流動力學指標檢測。通過連接測壓導管的生物信號采集系統(tǒng)記錄各組大鼠離體心臟組織心率（HR）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮壓（LVSP）、左室收縮壓最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒張壓最大下降速率（-dP/dtmin）。4）心臟組織抗氧化酶活性，MDA含量及Na+-ATP、Ca2+-ATP活性檢測。取各組剩余的8只大鼠離體心臟組織，于4℃環(huán)境剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿，制備10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min取上清液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計檢測心臟組織中抗氧化酶SOD、CAT活性，MDA含量以及Na+-ATP、Ca2+-ATP活性。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌酶活性比較 見表1。較正常對照組，模型組冠脈流出液心肌酶（GOT、LDH、CK-MB）活性均顯著升高（P＜0.01）；較模型組，丹參多酚酸鹽中、高劑量組和維拉帕米組冠脈流出液GOT、LDH、CKMB活性顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠離體心臟流出液心肌酶活性比較（U/L，±s）

表1 各組大鼠離體心臟流出液心肌酶活性比較（U/L，±s）

與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n CK-MB正常對照組 20 672.93±74.80模型組 20 1809.64±287.16**丹參多酚酸鹽低劑量組 20 1573.58±229.34 GOT LDH 9.74±2.03 8.65±2.71 62.80±15.28**91.76±16.35**53.19±14.53 72.24±15.90△丹參多酚酸鹽中劑量組 20 1106.82±185.93△26.72±5.91△△ 47.83±11.76△△丹參多酚酸鹽高劑量組 20 14.54±4.02△△ 25.46±8.05△△ 985.76±170.85△△維拉帕米組 20 40.15±15.41△ 53.74±12.95△△ 1083.26±190.68△

2.2 各組大鼠心臟梗死面積百分率比較 見表2。較正常對照組，模型組大鼠離體心臟梗死百分率顯著升高（P＜0.01）；較模型組，丹參多酚酸鹽中、高劑量組和維拉帕米組心臟梗死百分率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積百分率比較（%，±s）

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積百分率比較（%，±s）

組 別 n正常對照組 6模型組 6丹參多酚酸鹽低劑量組 6梗死百分率0.00±0.00 41.73±5.08**38.61±5.65丹參多酚酸鹽中劑量組 6 30.82±4.90△丹參多酚酸鹽高劑量組 6 22.76±4.41△△維拉帕米組 6 31.43±5.06△

2.3 各組大鼠心臟組織病變比較 見圖1。正常對照組大鼠離體心臟組織細胞形態(tài)未見異常；模型組心臟組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、間隙增寬、排列紊亂，細胞空泡變性、細胞質(zhì)著色不均、胞核深染等病變；較模型組，丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組和維拉帕米組離體心臟組織病變呈現(xiàn)不同程度改善，以高劑量組效果最為顯著。

圖1 各組大鼠離體心臟組織細胞形態(tài)（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠血流動力學指標監(jiān)測結(jié)果比較 見表3。較正常對照組，模型組大鼠離體心臟HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin顯著降低且LVEDP顯著升高（P＜0.01）；較模型組，丹參多酚酸鹽中、高劑量組和維拉帕米組HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin顯著升高且 LVEDP 顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠離體心臟血流動力學指標比較（±s）

表3 各組大鼠離體心臟血流動力學指標比較（±s）

組 別 n HR（次/min）LVEDP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）-dP/dtmin（mmHg/s）2408.16±325.49 1935.14±286.73 946.80±197.13** 782.86±195.32**1057.25±214.68 900.74±213.82丹參多酚酸鹽中劑量組 20 263.94±25.37△ 20.49±5.41△ 72.84±9.82△ 1469.07±235.39△ 1152.83±230.75△丹參多酚酸鹽高劑量組 20 270.85±27.26△△ 16.85±4.60△△ 79.17±11.06△△ 1772.94±286.17△△ 1481.90±254.76△△維拉帕米組 20 265.07±24.25△ 18.73±4.92△ 74.26±10.32△ 1693.41±220.68△△ 1416.07±219.35△△正常對照組 20模型組 20丹參多酚酸鹽低劑量組 20 LVSP（mmHg）278.14±28.49 7.38±2.19 87.04±10.06 243.82±25.15**34.26±9.50**61.25±9.72**251.67±24.80 27.15±6.36 64.92±10.15

2.5 各組大鼠抗氧化酶活性及MDA含量比較 見表4。較正常對照組，模型組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性均顯著降低（P＜0.01），MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；較模型組，丹參多酚酸鹽中、高劑量組SOD、CAT活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。維拉帕米組SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組大鼠離體心臟抗氧化酶活性及MDA含量比較（±s）

表4 各組大鼠離體心臟抗氧化酶活性及MDA含量比較（±s）

組 別 n MDA（nmol/mg）正常對照組 8 3.57±0.62模型組 8 9.65±1.70**丹參多酚酸鹽低劑量組 8 8.26±1.63 SOD（U/mg） CAT（U/mg）67.92±5.18 37.50±4.83 38.25±4.16** 16.39±3.52**41.06±4.82 20.17±3.95丹參多酚酸鹽中劑量組 8 6.40±1.25△△47.85±5.34△ 25.34±3.28△丹參多酚酸鹽高劑量組 8 55.17±5.83△△ 31.06±4.51△ 5.61±0.94△△維拉帕米組 8 48.35±5.29△ 22.17±4.35 6.82±1.36△△

2.6 各組大鼠Na+-ATP、Ca2+-ATP活性比較 見表5。較正常對照組，模型組大鼠離體心臟組織Na+-ATP、Ca2+-ATP活性顯著降低（P＜0.01）；較模型組，丹參多酚酸鹽中、高劑量組和維拉帕米組Na+-ATP、Ca2+-ATP活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠離體心臟組織Na+-ATP、Ca2+-ATP活性比較［μmoL/（mg·h），±s］

表5 各組大鼠離體心臟組織Na+-ATP、Ca2+-ATP活性比較［μmoL/（mg·h），±s］

組 別 n正常對照組 8模型組 8丹參多酚酸鹽低劑量組 8 Na+-ATP Ca2+-ATP 1.82±0.98 1.64±0.47 0.76±0.31** 0.70±0.26**0.91±0.34 1.02±0.37丹參多酚酸鹽中劑量組 8 1.59±0.53△ 1.48±0.41△△丹參多酚酸鹽高劑量組 8 2.03±0.85△△ 1.79±0.44△△維拉帕米組 8 1.91±0.72△△ 1.84±0.41△△

3 討 論

心肌組織缺血再灌注損傷是心肌梗死溶栓治療以及心臟手術(shù)術(shù)后常見并發(fā)癥，嚴重影響患者預后。病理生理學研究發(fā)現(xiàn)，血流動力學改變、氧化應激損傷以及ATP酶活性降低是心肌缺血再灌注損傷主要病理機制［4-6］，作為治療靶點用于新藥研究。

丹參多酚酸鹽是丹參的主要活性成分之一，本實驗釆用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，模擬心肌缺血再灌注損傷模型并給予不同劑量的丹參多酚酸鹽（10、20、40 mg/kg）進行干預治療，其中中等劑量（20 mg/kg）組是通過人臨床劑量換算的大鼠劑量，并以此為基礎(chǔ)設(shè)置低劑量（10 mg/kg）和高劑量（40 mg/kg）組。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參多酚酸鹽預處理能夠有效降低離體心臟冠脈流出液心肌酶（GOT、LDH、CK-MB）活性、降低心肌組織梗死面積、抑制心肌組織病變，表明丹參多酚酸鹽能夠減輕心肌細胞損傷、改善心功能，提示丹參多酚酸鹽對離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

正常的血流動力學是保證心臟功能的基礎(chǔ)。HR、LVEDP、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin是衡量血流動力學的重要指標。HR能夠反應心臟的整體功能，LVEDP能夠反映舒張期左室內(nèi)壓變化、LVSP反映收縮期左室內(nèi)壓變化，LVEDP和LVSP能夠體現(xiàn)心肌順應性；+dp/dtmax反映心肌收縮程度、-dp/dtmax反映心肌舒張功能，二者是評價心肌收縮性能和舒張性能的敏感指標［7-8］。張紅霞等［9］研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血/再灌注可能降低心肌舒縮功能，而表現(xiàn)為心輸出量減少及±dp/dtmax指標降低。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參多酚酸鹽預處理能夠有效提高離體心臟 HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin并降低 LVEDP，提示丹參多酚酸鹽具有改善離體心臟缺血再灌注損傷后血流動力學的藥理學作用。

氧化應激損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機制之一［10］，體內(nèi)氧自由基代謝失衡是氧化應激損傷的病理基礎(chǔ)，SOD、CAT是體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵還原酶［11-12］，MDA為脂質(zhì)過氧化反應終產(chǎn)物，因此SOD、CAT活性和MDA含量能夠間接反應心肌組織損傷的程度［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參多酚酸鹽預處理能夠有效改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性并降低MDA含量，提示丹參多酚酸鹽具有抑制離體心臟缺血再灌注后氧化應激損傷的作用。

Yongsheng K等［14］研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注將導致細胞內(nèi)Na+濃度升高，促進Na+-Ca2+交換而導致導致大量Ca2+內(nèi)流而致細胞內(nèi)Ca2+超載，進而引起細胞結(jié)構(gòu)損傷而致細胞死亡，是心臟組織缺血再灌注損傷的另一重要病理機制［15-18］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參多酚酸鹽預處理能夠有效提高Na+-ATP、Ca2+-ATP活性，從而有效緩解細胞內(nèi)Na+、Ca2+超載，這可能是丹參多酚酸鹽對離體心臟缺血再灌注損傷能夠起到一定保護作用的機制之一。

綜上所述，丹參多酚酸鹽能夠降低心肌組織梗死面積、抑制心肌組織病變而改善心功能，提示丹參多酚酸鹽對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與丹參多酚酸鹽能夠改善血流動力學、抑制氧化應激損傷以及改善Na+-ATP、Ca2+-ATP活性有關(guān)。

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