張 望，范廣宇，陳秀開

( 連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇 連云港 222042 )

撲草凈是我國使用較為廣泛的除草劑品種，因其穩(wěn)定性較高，撲草凈可通過地表徑流和滲透作用污染水體，進(jìn)入食物鏈，引起動物和人體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)異常[1-2]。

我國曾允許撲草凈用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。由于魚類對撲草凈的代謝規(guī)律不明確，無法評價其食品安全性，農(nóng)業(yè)部于2010年發(fā)布1435號公告，明確將撲草凈列入《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》[3]，但我國尚未對水產(chǎn)品中撲草凈的殘留限量作出要求[4]。目前歐盟禁止銷售和使用撲草凈，美、日兩國允許將撲草凈作為除草劑使用，但未將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。日本2006年起實施“食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度”，文蛤(Meretrixmeretrix)等貝類中撲草凈限量執(zhí)行“一律標(biāo)準(zhǔn)”，即0.01 mg/kg[5]。

文蛤是我國沿海常見的經(jīng)濟(jì)貝類，通常生長在河流入?？诟浇募?xì)沙質(zhì)灘涂和內(nèi)灣區(qū)域，生長位置相對固定[6]，受撲草凈污染的風(fēng)險較大。日本厚生勞動省分別在2012年8月[5]和2015年3月[7]通報檢出中國產(chǎn)文蛤體內(nèi)撲草凈殘留超標(biāo)，并發(fā)布命令檢查通報。目前多見文蛤?qū)χ亟饘俚母患?yīng)研究[8-10]，未見關(guān)于文蛤?qū)洳輧舻绒r(nóng)藥的富集和消退規(guī)律研究的報道。筆者在半靜態(tài)條件下研究了文蛤?qū)洳輧舻母患拖艘?guī)律，以期為文蛤的凈化暫養(yǎng)提供支撐，為貝類安全養(yǎng)殖和海洋環(huán)境保護(hù)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(QTRAP 4500，AB SCIEX，美國)；超聲波清洗器(KH800-KDB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAP，Organomation，美國)；旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(R-215，BUCHI，瑞士)。乙腈(色譜純，Merck)；甲醇(色譜純，Merck)；甲苯(優(yōu)級純，國藥)；氯化鈉(分析純，國藥)；無水硫酸鈉(分析純，國藥)；氨基柱(500 mg/3 mL，天津天興達(dá))。撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品由Dr．Ehrenstorfer提供，純度>98.0%。試驗用水為超純水。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法：用甲醇將定量稱取的撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品溶解并定容至100 mg/L，使用時根據(jù)所需用量用乙腈進(jìn)行稀釋。

1.2 富集和消除試驗

試驗用文蛤取自江蘇省連云港市贛榆區(qū)海岸潮間帶，殼長2.5～3.0 cm。試驗前在試驗條件下暫養(yǎng)7 d，日換水1次，定時投喂螺旋藻(哈爾濱市潔寶水族用品有限公司)1次。試驗容器為800 mm×600 mm×230 mm的長方形塑料水槽。試驗用水為深井水自配海水，鹽度23，pH 7.8～8.0[11]，連續(xù)充氧、加溫，保持水溫為(12±1) ℃，水中溶解氧>5.0 mg/L。經(jīng)檢測，試驗用文蛤、螺旋藻和試驗用水均不含撲草凈。

選擇活力良好的健康個體進(jìn)行試驗，隨機(jī)分為7組，每組約400枚文蛤，設(shè)1、10、100 μg/L 3個質(zhì)量濃度組和1個空白對照組。每個質(zhì)量濃度組在相同的試驗條件下設(shè)置2個重復(fù)組，將2組測定的平均值作為最終結(jié)果。富集和消除試驗在半靜態(tài)條件下進(jìn)行，日換藥液1次，同時投喂螺旋藻。富集試驗開始后分別于暴露后24 h(1 d)、48 h(2 d)、96 h(4 d)、144 h(6 d)、240 h(10 d)、336 h(14 d)、432 h(18 d)、528 h(22 d)、624 h(26 d)采樣，每次采樣隨機(jī)從各組取出18枚文蛤，分別放入標(biāo)記清楚的自封口塑料袋中密封，-18 ℃冷凍保存。富集試驗結(jié)束后進(jìn)行消除試驗，每12 h將所有試驗容器內(nèi)的水換成清潔自配海水，分別在試驗開始后的第24 h(1 d)、48 h(2 d)、96 h(4 d)、192 h(8 d)、336 h(14 d)、432 h(18 d)、和528 h(22 d)進(jìn)行采樣。投喂、采樣方法同富集試驗。試驗過程中及時撈出死亡的文蛤。

1.3 撲草凈含量的測定

用濾紙將所取文蛤殼表面擦干，剖開取出所有可食部分，用均質(zhì)機(jī)制成勻漿，稱取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL塑料離心管中。樣品預(yù)處理和儀器測定條件均參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，檢出限為1.0 μg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

每個時間點的測定值取重復(fù)組的平均值。

富集系數(shù)即生物體內(nèi)污染物的質(zhì)量濃度與其生存環(huán)境中該污染物質(zhì)量濃度的比值，用公式表示為：

BCF=Ct/C0

式中，BCF為富集系數(shù)，Ct表示文蛤體內(nèi)撲草凈含量(μg/kg)，C0表示試驗水體中撲草凈含量(μg/kg)。

消除速率是污染物在單位時間內(nèi)從生物體內(nèi)的從體內(nèi)的消除量，公式表示為：

v=Δc/Δt

式中，v為消除速率[μg/(kg·d)]，Δt表示消除試驗所用的時間(d)，Δc表示消除試驗所用時間內(nèi)，文蛤體內(nèi)撲草凈的消除量(μg/kg)。

采用PKSolver 2.0藥物代謝動力學(xué)參數(shù)計算程序，在計算機(jī)上處理文蛤的撲草凈含量—時間數(shù)據(jù)，計算出有關(guān)藥物動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 文蛤?qū)Σ煌|(zhì)量濃度撲草凈的富集規(guī)律

分別做1、10、100 μg/L 3個暴露質(zhì)量濃度下文蛤體內(nèi)撲草凈含量隨時間變化的富集含量—時間圖(圖1)。撲草凈在文蛤體內(nèi)的富集含量呈先增后降的趨勢，而后分別在不同水平(17.5、70.2、391.5 μg/kg)波動。富集含量達(dá)到最大值所需時間分別為10、14 d和18 d，最大含量分別為22.9、82.6、431.1 μg/kg，分別為水體中撲草凈質(zhì)量濃度的22.9倍、8.3倍和4.3倍。富集試驗結(jié)束時，在1、10、100 μg/L暴露質(zhì)量濃度下的文蛤體內(nèi)撲草凈含量分別為18.0、69.3、395.9 μg/kg，分別為暴露質(zhì)量濃度的18.0倍、7.0倍和4.0倍。

圖1 不同暴露質(zhì)量濃度下文蛤體內(nèi)撲草凈含量—時間曲線

以撲草凈暴露質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，文蛤體內(nèi)撲草凈的含量為縱坐標(biāo)，分別對24、48、96、144、240、336、432、528、624 h的暴露質(zhì)量濃度—富集含量關(guān)系做線性回歸分析(表1)。對回歸方程進(jìn)行t檢驗，相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在相同的暴露時間，文蛤體內(nèi)撲草凈的含量隨著暴露質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，二者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

在1、10、100 μg/L 3個暴露質(zhì)量濃度下，文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)變化趨勢相同，表現(xiàn)為先升后降，至某一水平維持波動狀態(tài)(圖2)。文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)最高值分別達(dá)22.9、8.3和4.3。在每個時間點文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)均隨暴露質(zhì)量濃度的升高而下降，表明隨著暴露質(zhì)量濃度的升高，文蛤?qū)洳輧舻母患手鸩较陆怠?/p>

表1 暴露質(zhì)量濃度—富集含量關(guān)系線性回歸

圖2 文蛤暴露在不同質(zhì)量濃度的撲草凈中的富集系數(shù)—時間曲線

2.2 文蛤?qū)洳輧舻南?guī)律

在22 d的消除試驗過程中，1、10、100 μg/L 3個試驗組文蛤體內(nèi)撲草凈含量均明顯下降(圖3)。在消除試驗第4 d，撲草凈含量均降至消除試驗開始前的50%以上；在消除試驗第22 d，1、10、100 μg/L 3個試驗組文蛤體內(nèi)撲草凈含量分別降至1.6、2.9、10.4 μg/kg，分別為消除試驗開始時的8.7%、5.6%和2.6%。1、10、100 μg/L 3個試驗組文蛤?qū)洳輧舻钠骄怂俾史謩e為0.745、2.973、17.522 μg/(kg·d)。消退速率隨著暴露質(zhì)量濃度的升高而升高。結(jié)果說明，脫離暴露環(huán)境一定時間可降低文蛤體內(nèi)撲草凈的含量。

圖3 文蛤體內(nèi)撲草凈含量隨時間的消除變化曲線

2.3 富集動力學(xué)參數(shù)測定結(jié)果

采用PKSolver 2.0藥物代謝動力學(xué)參數(shù)計算程序，處理曝污后文蛤體內(nèi)的撲草凈含量—時間數(shù)據(jù)，計算有關(guān)撲草凈在文蛤體內(nèi)的動力學(xué)參數(shù)(表2)。

表2 文蛤?qū)洳輧舻乃幬锎x動力學(xué)參數(shù)

注：t1/2β：藥物的消除半衰期(h)；Tlag：時滯(h)；AUC：藥時曲線下面積[μg/(L·h)]；Cmax：富集達(dá)到平衡后，體內(nèi)氨基脲含量(μg/kg)；Tmax：富集達(dá)到平衡的時間(h)；CL/F：總體清除率[L/(h·kg)].

2.4 藥時曲線下面積

藥時曲線下面積是指生物體內(nèi)藥物濃度曲線對時間軸所包圍的面積，反映藥物進(jìn)入體循環(huán)的相對量，代表藥物被生物體吸收利用的程度。在1、10、100 μg/L暴露質(zhì)量濃度下，文蛤藥時曲線下面積依次為13093.366 μg/(L·h)(1 μg/L)< 49937.208 μg/(L·h)(10 μg/L)< 262958.232 μg/(L·h)(100 μg/L)。說明不同的暴露質(zhì)量濃度下，文蛤?qū)洳輧舻母患芰τ休^大差別。

2.5 藥物消除半衰期

藥物消除半衰期是指藥物質(zhì)量濃度下降一半所需要的時間。其長短可反映生物體內(nèi)的藥物消除速度。在1、10、100 μg/L暴露質(zhì)量濃度下，文蛤的藥物消除半衰期依次為220.241 h(1 μg/L)>128.065 h(10 μg/L)> 108.780 h(100 μg/L)。說明文蛤體內(nèi)撲草凈含量越高，消除速率越快。

3 討 論

3.1 文蛤?qū)洳輧舻母患?/h3>

在本試驗中，隨著暴露質(zhì)量濃度的增加，文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)降低，說明在低暴露質(zhì)量濃度的情況下，文蛤?qū)洳輧舻母患饔酶鼜?qiáng)。這種富集系數(shù)隨暴露質(zhì)量濃度增加而減小的現(xiàn)象與文蛤[8-10]和魁蚶(Scapharcabroughtonii)[13]對重金屬銅和鉛、汞、砷富集規(guī)律，以及仿刺參(Apostichopusjaponicus)[14]和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[15]對撲草凈的富集規(guī)律研究結(jié)論類似。生物體對污染物的吸收主要取決于生物體體內(nèi)脂肪與水體中有機(jī)物的分配[16]。在脂溶相分配平衡過程中，高暴露質(zhì)量濃度組文蛤體內(nèi)撲草凈質(zhì)量濃度相對增加較快，體內(nèi)脂肪與撲草凈結(jié)合更易達(dá)到飽和，導(dǎo)致隨著撲草凈暴露質(zhì)量濃度的增加，文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)逐漸減小。

在暴露質(zhì)量濃度為1 μg/L和10 μg/L情況下，文蛤?qū)洳輧舻淖畲蟾患禂?shù)分別為22.9和8.3，而仿刺參和菲律賓蛤仔對相同質(zhì)量濃度撲草凈的最大富集系數(shù)分別為4.70和4.38、40.3和9.54。從文蛤?qū)洳輧舾患臅r間效應(yīng)來看，各暴露質(zhì)量濃度下，隨著暴露時間的增加，文蛤體內(nèi)的撲草凈含量升高至最大值后出現(xiàn)下降，而后富集速率和分解代謝速率維持在一個動態(tài)平衡中，撲草凈含量保持微小波動。在暴露質(zhì)量濃度為1 μg/L和10 μg/L的情況下，文蛤?qū)洳輧舻母患窟_(dá)到最大值所需時間分別為10 d和14 d，而田秀慧等[14-15]的研究表明，仿刺參和菲律賓蛤仔對撲草凈的富集含量達(dá)到最大值所需時間僅為1～3 d。這種差異說明，不同品種的水生動物對撲草凈的富集能力可能存在較大差異。不同品種水生動物的生理機(jī)能、體脂含量與組成、代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制和效率等方面的差異，是導(dǎo)致富集能力差異的重要原因[17]。在適宜貝類生存的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，貝類的濾水率和攝食率以冪函數(shù)的形式升高[18-19]，從而影響富集速率。本試驗的水溫為(12±1) ℃，低于菲律賓蛤仔(20±1) ℃的試驗水溫[15]，可能也是富集速率差異較大的原因之一。

3.2 文蛤?qū)洳輧舻南?/h3>

在22 d的消除試驗過程中，各試驗組的文蛤體內(nèi)撲草凈含量下降趨勢逐漸趨緩，說明隨著體內(nèi)撲草凈殘留量的減少，文蛤?qū)洳輧舻拇x效率也逐漸下降。消除試驗第4 d，各試驗組的文蛤體內(nèi)撲草凈含量均降至消除試驗開始前的50%以上。而對菲律賓蛤仔中撲草凈殘留的消除規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，消除試驗開始后1 d，撲草凈含量約降90%[15]。這種差異說明文蛤和菲律賓蛤仔對撲草凈的代謝能力可能存在較大差異。通常水溫每升高1 ℃，水生動物的藥物代謝和消除速率提高10%[20-21]。本試驗的水溫為(12±1) ℃，低于菲律賓蛤仔(20±1) ℃的試驗水溫[15]，可能也是消除速率差異較大的原因之一。

目前國內(nèi)對水產(chǎn)品中撲草凈殘留無限量要求。日本實施肯定列表制度，文蛤等貝類中撲草凈含量適用于0.01 mg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”。對萊州灣海域表層海水中三嗪類除草劑殘留的調(diào)查結(jié)果顯示，該區(qū)域海水中撲草凈質(zhì)量濃度最高達(dá)21.2 ng/L[22]。本課題組在豐水期和枯水期分別對連云港、南通沿海部分潮間帶海水，以及相關(guān)入?？谏嫌蔚{(diào)查結(jié)果顯示，撲草凈含量均低于100 ng/L。推斷上述海域生長的文蛤體內(nèi)撲草凈殘留量應(yīng)小于22.904 μg/kg。通常情況下，采捕上岸的文蛤在上市前僅做簡單清洗，未進(jìn)行一定時間暫養(yǎng)。根據(jù)本試驗結(jié)果推測，文蛤采捕后，在12 ℃以上的清潔海水中暫養(yǎng)4 d以上，可控制撲草凈殘留超標(biāo)的風(fēng)險。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，在1、10、100 μg/L的撲草凈暴露質(zhì)量濃度下，文蛤分別于暴露后10、14、18 d達(dá)到對撲草凈的最大富集含量，分別為22.9、82.6、431.1 μg/kg。隨著暴露時間的增加，文蛤體內(nèi)撲草凈含量變化趨勢為先升后降，而后維持在某一水平波動。文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)隨暴露質(zhì)量濃度的增加而減小。消除試驗過程中，文蛤體內(nèi)撲草凈含量均明顯下降。消除試驗結(jié)束時，各試驗組的文蛤體內(nèi)仍有撲草凈檢出?？梢娢母?qū)洳輧舻母患拖芰^強(qiáng)，但短時間內(nèi)難以徹底消除。

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