梁靜真，馬 沙，肖雙燕，韓書煜，黃艷華，黃德生，張振豪，呂忠堅，覃志彪，黃 鈞*

(1. 廣西大學動物科學技術學院/廣西水生動物病害診斷實驗室，廣西 南寧 530005；2. 廣西水產(chǎn)技術推廣總站，廣西 南寧 530022；3. 欽州市水產(chǎn)技術推廣站，廣西 欽州 535000；4. 北海市合浦縣水產(chǎn)技術推廣站，廣西 北海 536100；5. 防城港市企沙鎮(zhèn)水產(chǎn)技術推廣站，廣西 防城港 538002)

【研究意義】凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)又稱南美白對蝦，具有生長快、肉鮮美、營養(yǎng)需求低、適應性強等優(yōu)點[1]。自1996年引進廣西后，目前已成為廣西沿海最主要的對蝦養(yǎng)殖品種。但近年來，對蝦病毒性疾病的流行，常給廣大養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，已成為當前制約廣西凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要因素。由白斑綜合癥病毒(WSSV)引起的白斑綜合癥是危害極大的對蝦病毒性疾病之一，可引起各種野生和養(yǎng)殖對蝦發(fā)病，常呈暴發(fā)性流行且死亡率極高[2-8]。另一種危害嚴重的對蝦病毒性疾病慢性矮小殘缺綜合癥是由傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)引起[9]，該病也可危害各種養(yǎng)殖對蝦，主要引起對蝦生長趨緩、表皮殘缺粗糙等，在紅額角對蝦中可引起90 %的死亡率[10]；該病毒可通過垂直[11]和水平[12]的方式進行傳播。開展WSSV和IHHNV的流行病學監(jiān)測調查，掌握病毒流行規(guī)律，對凡納濱對蝦的疾病預防意義重大?！厩叭搜芯窟M展】有關WSSV和IHHNV的流行情況調查，國內(nèi)外學者已有不少報道。在印度養(yǎng)殖和捕撈對蝦中，WSSV分布廣泛[13]。在菲律賓，WSSV在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)蝦苗和中成蝦的檢出陽性率分別為50 %和79 %[14]。而蝦苗WSSV的檢出陽性率與對親蝦進行的WSSV檢測有關[15]。Iqbal等[16]和Chakrabarty等[17]發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦親蝦和幼蝦WSSV感染率受季節(jié)和環(huán)境等因素的影響。最近的研究結果表明，不同地區(qū)養(yǎng)殖的對蝦其WSSV檢出陽性率也不盡相同[18]。已知IHHNV在秘魯、墨西哥等美洲國家，東亞、東南亞、中東和澳大利亞等地均有分布[19]，其在宿主間的流行與水產(chǎn)品的貿(mào)易有關[20]。在中國，張聰[21]對采集自浙江、廣東等7個地區(qū)的凡納濱對蝦樣品進行了IHHNV檢測，但未對不同生長階段對蝦感染情況進行分析；施慧等[22]及朱凝瑜等[23]檢測了浙江省凡納濱對蝦蝦苗IHHNV和WSSV病毒的攜帶情況；謝芝勛等[24]和龐耀珊等[25]采用二溫式多重PCR法對廣西沿海對蝦病樣進行了WSSV和IHHNV的檢測，但均未對2種病毒在廣西的地理分布特點進行分析；童桂香等[9]僅對廣西沿海凡納濱對蝦的IHHNV病毒進行了檢測?！颈狙芯壳腥朦c】WSSV和IHHNV是凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中常見可導致大量死亡的病原，給養(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟損失。但對這2種病毒近年來在廣西分布情況、流行特點和流行趨勢的報道仍不多見?！緮M解決的關鍵問題】廣西是我國凡納濱對蝦的主產(chǎn)區(qū)和出口的重要基地之一，建立對蝦重要病毒的檢測和監(jiān)控制度十分必要。2013年起，對廣西凡納濱對蝦主要養(yǎng)殖區(qū)2種對蝦病毒W(wǎng)SSV和IHHNV的感染情況進行了連續(xù)調查研究，旨在了解WSSV和IHHNV在不同養(yǎng)殖區(qū)和對蝦不同生長階段的流行情況和趨勢，掌握這2種病毒的流行規(guī)律，為制定廣西凡納濱對蝦WSSV和IHHNV病的綜合防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在廣西凡納濱對蝦主產(chǎn)區(qū)欽州市、防城港市和北海市設WSSV和IHHNV 2種對蝦病毒的監(jiān)測區(qū)，每個監(jiān)測區(qū)設立15～25個采樣點(凡納濱對蝦養(yǎng)殖場及蝦苗場)，其中定點采樣點至少有3個，臨時采樣點根據(jù)面上養(yǎng)殖的發(fā)病情況定。各采樣點地理坐標范圍如下，欽州：N 21°37′49″～ 21°57′28″，E 108°30′36″～108°50′23″；防城港：N 21°31′56″～ 21°43′17″，E 108°10′48″～ 108°34′41″；北海：N 21°36′48″～ 21°44′00″，E 109°04′50″～ 109°11′51″(圖1)。每次每個養(yǎng)殖場及蝦苗場的蝦樣設為1份樣品，每份樣品的采集量不少于200尾。2013-2016年每年5-9月采樣4～5次，共采集蝦苗和中成蝦樣品688份。其中蝦苗樣品301份，規(guī)格約1.00 cm，質量約0.0046 g/尾，每份樣品不少于200尾；中成蝦樣品共387份，規(guī)格6.00～12.00 cm，質量約3.5000～26.0000 g/尾。各監(jiān)測區(qū)的分年度采樣情況見表1。

表1 2013-2016年樣品采集份數(shù)Table 1 Copies of collected samples during 2013-2016

WSSV和IHHNV陽性對照和陰性對照樣品為本實驗室已保存樣。蝦苗樣品為活蝦，固定采樣點為現(xiàn)場采集并立即用95 %酒精固定；臨時采樣點的樣品為用塑料袋密封充氧后低溫運輸至實驗室以95 %酒精固定保存。成蝦樣品定點采樣點為現(xiàn)場采集活體，臨時采樣點為加冰塊低溫保存并于3 h內(nèi)運至實驗室，成蝦樣均取其頭部以95 %酒精固定后密封瓶中保存。所有蝦樣與95 %酒精的比例均在1∶10以上，第1次固定后1～2 h更換1次酒精，成蝦樣24 h后再更換1次。酒精固定的樣品置于4 ℃保存。所有固定樣品均在30 d內(nèi)完成檢測。

1.2 試驗方法

將已固定蝦樣碾碎，其中蝦苗樣品去掉蝦眼，中成蝦取蝦鰓、胃及游泳足樣品。取勻漿樣品約30 mg 懸浮于 200 μl TE，按照購自天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物基因組提取試劑盒說明書進行DNA提取[2]，DNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

WSSV檢測采用國家標準《GB/T 28630.2-2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測法》[26]的引物和方法進行PCR擴增，擴增片段為病毒結構蛋白VP664部分序列[27]。PCR產(chǎn)物用1.5 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結果。陽性樣品的PCR產(chǎn)物送至華大基因測序，測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的WSSV序列進行比對，進一步驗證結果的準確性。

圖1 凡納濱對蝦采樣點所在位置Fig.1 Location of sampling sites of Penaeus vannamei

IHHNV檢測采用國家標準《GB/T 25878-2010對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV) 檢測PCR法》[28]的引物和方法進行PCR擴增，擴增片段為非結構蛋白-1基因部分序列。PCR產(chǎn)物用1.5 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結果。陽性樣品的PCR產(chǎn)物送至華大基因測序，測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的IHHNV序列進行比對，進一步驗證結果的準確性。

參考彭亞[2]的方法，采用DNASTAR軟件和MEGA 5.0軟件分別進行序列相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

樣品的陽性率按以下公式計算：陽性率( %)=陽性樣品數(shù)/被檢樣品數(shù)×100[29]。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，差異性檢驗為χ2檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

2.1.1 WSSV檢測結果 從圖2可以看出，陽性樣品(如4、5、6號樣品和陽性對照)在第1次PCR結果顯示于1447 bp處有條帶或無條帶；第2次PCR結果顯示在約941 bp處有明顯條帶。陰性樣品(如1、2、3號樣品和陰性對照)則在1447 或941 bp處均無條帶。對陽性PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并將所得序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結果顯示PCR陽性樣品測序片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的WSSV陽性株序列相似性高。

A: 第1次PCR反應結果；B: 第2次PCR反應結果 M: DNA marker; P: WSSV陽性對照；N: 陰性對照；1～6: 部分樣品A: Results of the first round PCR; B: Results of the second round PCR; M: DNA marker; P: Positive control of WSSV; N: Negative control; Lane 1-6: Several samples圖2 部分樣品WSSV套式PCR的檢測結果Fig.2 Detection of WSSV in several samples by nested PCR

從每個監(jiān)測區(qū)WSSV檢測為陽性的樣品中隨機抽取1個樣品(分別為欽州株QZ54、北海株BH86和防城港株FCG13)進行分析。基于941 bp左右的基因片段序列，與GenBank上已知的WSSV核苷酸序列進行同源性比較，結果表明欽州株QZ54、北海株BH86和防城港株FCG13之間的WSSV核苷酸同源性為99.7 %～99.9 %，與中國大陸株(AF332093)、中國臺灣株(AF440570)、韓國株(AF361753)、泰國株(AF369029)及孟加拉株(KJ773998)相似性相對較高，核苷酸同源性為99.8 %～100.0 %；與越南株(JX564899)核苷酸同源性為91.7 %～99.9 %；與伊朗株(KT894040)相似性相對較低，核苷酸同源性為86.3 %～86.5 %。系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果(圖3)顯示，欽州株QZ54、北海株BH86、防城港株FCG13與中國株(AF332093)、中國臺灣株(AF440570)、韓國株(AF361753)、泰國株(AF369029)、孟加拉株(KJ773998)、越南株(JX564899)聚為一簇，在進化關系上相對較近；與伊朗株(KT894040)在進化關系上相對較遠。

2.1.2 IHHNV檢測結果 部分被檢對蝦樣品的PCR檢測結果見圖4。陽性樣品(如1～8號樣品和陽性對照)在約389 bp處有明顯條帶，陰性樣品(如陰性對照)則在389 bp處無條帶。對陽性樣品的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的IHHNV序列進行比對，結果顯示PCR陽性樣品測序片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的IHHNV序列相似性高。

圖3 基于WSSV結構蛋白VP664基因部分序列(941 bp)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of partial sequence (941 bp) of WSSV structural protein VP664 gene

M: DNA marker; P: IHHNV陽性對照；N: 陰性對照；1～8: 部分樣品M: DNA marker; P: Positive control of IHHNV; N: Negative control; Lane 1-8: Several samples圖4 部分樣品IHHNV的PCR檢測結果Fig.4 Detection of several samples by PCR

從每個監(jiān)測區(qū)IHHNV檢測為陽性的樣品中隨機抽取1個樣品(分別為欽州株QZ87、北海株BH65和防城港株FCG125)進行分析?；?89 bp左右的基因片段序列，與GenBank上已知的IHHNV核苷酸序列進行同源性比較，欽州株QZ87、北海株BH65和防城港株FCG125之間IHHNV核苷酸同源性為99.2 %～99.3 %，與中國福建株(EF633688)、中國臺灣株(DQ057982)、中國湛江株(KR364612)、韓國株(JN377975)和馬來西亞株(HM536212)相似性相對較高，核苷酸同源性為98.2 %～99.5 %；與越南株(JN616415)、泰國株(AY102034)、印度株(GQ411199)和中國杭州株(KR364607)的核苷酸同源性為97.2 %～98.5 %；與澳大利亞株(EU675312)和馬達加斯加株(DQ228358)相似性相對較低，核苷酸同源性為91.6 %～92.6 %。

系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果(圖5)顯示，欽州株QZ87、北海株BH65、防城港株FCG125與中國福建株(EF633688)、中國臺灣株(DQ057982)、中國湛江株(KR364612)、韓國株(JN377975)、馬來西亞株(HM536212)聚為一簇，在進化關系上相對較近；與澳大利亞株(EU675312)和馬達加斯加株(DQ228358)在進化關系上相對較遠。

圖5 基于IHHNV非結構蛋白-1基因部分序列(389 bp)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of partial sequence (389 bp) of IHHNV non-structural protein 1 gene

表2 2013-2016年廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦WSSV病毒陽性率總檢測結果Table 2 Total detection results of positive rate of WSSV among P. vannamei samples in coastlands of Guangxi during 2013-2016 (%)

注：括號中數(shù)字表示病毒檢測為陽性的蝦樣數(shù)與被檢測蝦樣數(shù)之比。下同。

Notes: Numbers in the brackets indicate the numbers of virus-positive shrimps versus detected shrimps. The same as below.

2.2 廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦WSSV流行情況

2.2.1 不同監(jiān)測區(qū)WSSV的感染情況 對2013-2016年欽州、防城港和北海對蝦樣品的WSSV檢測結果(表2)顯示，WSSV在3個監(jiān)測區(qū)均有不同程度的流行。2013-2016年，廣西沿海WSSV年度總檢出陽性率呈先下降后上升現(xiàn)象，但各年度之間差異不顯著(P>0.05，下同)。各個監(jiān)測區(qū)WSSV的檢出陽性率在不同年度間均有所不同。其中欽州2014年的檢出陽性率顯著低于2013、2015及2016年(P<0.05，下同)；防城港和北海的檢出陽性率在2013-2016年間差異均不顯著(P>0.05)。同一年度3個監(jiān)測區(qū)WSSV的檢出陽性率比較如下：2013年，欽州>北海>防城港；2014年，北海>防城港>欽州；2015年，欽州>北海>防城港；2016年，欽州>防城港>北海；其差異均不顯著。

2.2.2 不同生長階段蝦體WSSV的感染情況 2013、2015和2016年3個監(jiān)測區(qū)蝦苗WSSV的總體陽性檢出率顯著低于中成蝦的陽性檢出率，2014年蝦苗和中成蝦的WSSV陽性檢出率無顯著差異。除北海2014年蝦苗WSSV陽性率高于中成蝦外，其余各監(jiān)測區(qū)各年份蝦苗WSSV陽性率一般小于中成蝦陽性率，檢測結果見表3。

2013-2016年北海蝦苗WSSV的檢出陽性率均高于欽州和防城港蝦苗陽性率，防城港蝦苗的檢出陽性率在3個監(jiān)測區(qū)中為最小。各監(jiān)測區(qū)蝦苗檢出陽性率的周年比較如下：欽州為2015年>2014年>2013年=2016年，防城港為2015年>2013年=2014年=2016年，北海為2014年>2015年>2016年>2013年。除北海外，其余2個監(jiān)測區(qū)各年度間差異均不顯著。

2013、2015及2016年，中成蝦WSSV的檢出陽性率以欽州為最高，2014年防城港最高。各監(jiān)測區(qū)不同年度的中成蝦WSSV檢出陽性率比較如下：欽州為2015年>2016年>2013年>2014年，防城港為2016年>2013年>2015年>2014年，北海為2015年>2013年>2016年>2014年。除欽州外，其余2個監(jiān)測區(qū)各年度間差異均不顯著。

2.3 廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦IHHNV流行情況

2.3.1 不同監(jiān)測區(qū)IHHNV的感染情況 對2013-2016年廣西欽州、防城港和北海對蝦的IHHNV檢測結果(表4)表明，2013年3個監(jiān)測區(qū)IHHNV的檢出陽性率均顯著高于其他年份，其中欽州、防城港2014-2016年和北海2016年的對蝦樣品中均未檢出IHHNV；同一年度的3個監(jiān)測區(qū)之間的IHHNV檢出陽性率比較如下：2013年，欽州>北海>防城港，差異顯著；2014-2015年，北海>防城港=欽州，差異不顯著；2016年3個監(jiān)測區(qū)IHHNV檢測均為陰性。

2.3.2 不同生長階段蝦體IHHNV的感染情況 2013-2016年，3個監(jiān)測區(qū)蝦苗總陽性率顯著小于中成蝦陽性率，蝦苗和中成蝦IHHNV總陽性率均呈顯著下降趨勢。除欽州2013年蝦苗IHHNV陽性率高于中成蝦外，各監(jiān)測區(qū)各年份蝦苗IHHNV陽性率一般小于或等于中成蝦陽性率。

表3 2013-2016年廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦(蝦苗和中成蝦)WSSV病毒陽性率檢測結果Table 3 Detection results of positive rate of WSSV among P. vannamei samples (juvenile and adult shrimps) in coastlands of Guangxi during 2013-2016 (%)

表4 2013-2016年廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦IHHNV病毒陽性率總檢測結果Table 4 Total detection results of positive rate of IHHNV among P. vannamei samples in coastlands of Guangxi during 2013-2016 (%)

表5 2013-2016年廣西沿海不同地區(qū)凡納濱對蝦(蝦苗和中成蝦)IHHNV病毒陽性率檢測結果Table 5 Detection results of positive rate of IHHNV among P. vannamei samples (juvenile and adult shrimps) in coastlands of Guangxi during 2013-2016 (%)

根據(jù)表5，2013年欽州蝦苗IHHNV的檢出陽性率最高，并顯著高于防城港和北海；2014年3個監(jiān)測區(qū)檢出陽性率之間差異不顯著；2015-2016年3個監(jiān)測區(qū)檢測結果均為陰性。4年間，3個監(jiān)測區(qū)蝦苗IHHNV檢出陽性率均呈下降趨勢。其中，欽州為2013年>2014年=2015年=2016年，防城港為2013年>2014年=2015年=2016年，北海為2013年>2014年>2015年=2016年。

2013年欽州和北海中成蝦的IHHNV檢出陽性率顯著高于防城港，2014和2015年北海顯著高于欽州和防城港，2016年在中成蝦樣品中均未檢出IHHNV。4年間，中成蝦的IHHNV檢出陽性率如下：欽州為2013年>2014年=2015年=2016年，防城港為2013年>2014年=2015年=2016年，北海為2013年>2015年>2014年>2016年。

2.4 廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦WSSV和IHHNV混合感染情況

根據(jù)檢測結果(表6)，2013-2016年間，同時攜帶WSSV和IHHNV的樣品比例為蝦苗1.0 %，中成蝦8.8 %，同時攜帶2種病毒的樣品中，蝦苗比例顯著小于中成蝦；2013-2016年，同時攜帶WSSV和IHHNV的樣品所占比例逐年顯著減少，其中，同時攜帶WSSV和IHHNV的蝦苗樣品所占比例逐年變化差異不明顯，但同時攜帶2種病毒的中成蝦樣品所占比例逐年顯著減少。

2.5 廣西沿海地區(qū)凡納濱對蝦不同養(yǎng)殖月份2種病毒感染情況

對不同養(yǎng)殖月份的WSSV陽性率檢測結果(表7)顯示，2013年5、7和9月廣西沿海凡納濱對蝦的WSSV陽性率依次為1.0 %、9.6 %和40.2 %；2014年5-9月依次為17.5 %、42.9 %、0.0 %、34.8 %和5.1 %；2015年5-9月依次為22.2 %、23.8 %、38.9 %、3.7 %和22.2 %；2016年5-9月依次為20.0 %、5.6 %、33.3 %、0.0 %和77.8 %。

表6 2013-2016年凡納濱對蝦樣品WSSV和IHHNV 陽性率PCR檢測結果Table 6 Detection of positive rates of WSSV and IHHNV in P. vannamei samples by PCR during 2013-2016 (%)

表7 2013-2016年廣西沿海凡納濱對蝦不同養(yǎng)殖月份的WSSV陽性率檢測結果Table 7 Detection of positive rate of WSSV among P. vannamei samples in different culture months in coastlands of Guangxi during 2013-2016 (%)

表8 廣西沿海凡納濱對蝦不同養(yǎng)殖月份的IHHNV陽性率檢測結果Table 8 Detection of positive rate of IHHNV among P. vannamei samples in different culture months in coastlands of Guangxi (%)

由表8可以看出，2013年5、7及9月，廣西沿海凡納濱對蝦的IHHNV檢出陽性率依次為41.7 %、28.7 %和41.7 %；2014年5-9月依次為0.0 %、0.0 %、0.0 %、4.3 %和5.1 %；2015年5-9月依次為0.0 %、0.0 %、5.6 %、7.4 %和0.0 %；2016年5-9月均為陰性(0.0 %)。

3 討 論

根據(jù)本研究結果，2013-2016年的4年間，廣西沿海凡納濱對蝦蝦苗WSSV總陽性率顯著小于中成蝦總陽性率，蝦苗IHHNV總陽性率也顯著小于中成蝦陽性率。其原因可能有：①原本不攜帶病毒的對蝦可能在養(yǎng)殖過程中通過各種水平傳播途徑感染W(wǎng)SSV或IHHNV。大量研究結果表明，健康對蝦容易通過攝食被WSSV或IHHNV污染的餌料、浮游生物或病蝦排泄物而患病[20, 22, 30-34]，也可通過浸泡的方式感染W(wǎng)SSV[32]。對蝦養(yǎng)殖密度過大和養(yǎng)殖水質惡化(如低氧，高溫，氨氮、亞硝酸鹽超標等)也會導致疾病傳播速度加快以及感染程度加重[35-36]。在孟加拉，斑節(jié)對蝦親蝦和幼蝦WSSV感染率在雨季較高，在水流、鹽度、潮汐相對穩(wěn)定的冬季感染率較低[16]。印度斑節(jié)對蝦的WSSV陽性率在雨季最高，并隨著緯度降低而升高[17]。②Sanchez-Zazueta等[37]報道，將被病毒粒子污染的水引入到蝦池是病毒傳播的主要來源。據(jù)實地走訪發(fā)現(xiàn)，許多對蝦養(yǎng)殖戶都有不良養(yǎng)殖習慣，如將未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水直接排入海里，而其他養(yǎng)殖場又重新引入未經(jīng)徹底消毒的海水等，這在一定程度上擴大了WSSV和IHHNV病毒的傳播。Withyachumnarnkul等[15]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常對親蝦進行WSSV檢測的蝦苗場，其蝦苗WSSV陽性率要顯著低于未進行檢測的蝦苗場?；谶@兩方面原因，我們認為，在把握好親蝦和蝦苗的品質之外，加強養(yǎng)殖管理也是控制WSSV和IHHNV病毒傳播的有效措施。

基于941 bp的WSSV結構蛋白部分序列，欽州株QZ54、北海株BH86、防城港株FCG13與中國大陸株(AF332093)、中國臺灣株(AF440570)、韓國株(AF361753)、泰國株(AF369029)、孟加拉株(KJ773998)相似性較高，核苷酸同源性為99.8 %～100.0 %；與伊朗株的相似性較低，核苷酸同源性為86.3 %～86.5 %。本研究推測試驗中欽州株QZ54、北海株BH86及防城港株FCG13可能與中國大陸株、中國臺灣株、韓國株、泰國株及孟加拉株等東亞或東南亞毒株有共同的祖先株，而伊朗株則隨著養(yǎng)殖對蝦在西亞傳播擴散的過程中發(fā)生了較大的變異。該941 bp的結構蛋白序列仍然屬于相對比較保守的片段，如果結合WSSV變異區(qū)片段(如ORF14/15、ORF23/24)的缺失分析將有助于更進一步了解WSSV在對蝦養(yǎng)殖過程中的傳播和演化[38]。

IHHNV系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，欽州株QZ87、北海株BH65、防城港株FCG125與中國臺灣株(DQ057982)、馬來西亞株(HM536212)以及中國湛江株(KR364612)等分離株親緣關系較近，核苷酸同源性在98.2 %～99.5 %之間，結合文獻可知這幾株均為Ⅰ型感染株，其祖先可能來源于菲律賓[39-40]；中國杭州株(KR364607)與越南斑節(jié)對蝦株(JN616415)等其他東南亞分離株為Ⅱ型感染株[40-41]；欽州株QZ87、北海株BH65、防城港株FCG125與非感染型的澳大利亞株(EU675312)和馬達加斯加株(DQ228358)則親緣關系較遠[39]，核苷酸同源性為91.6 %～92.6 %。不同地區(qū)毒株之間地理起源的不同可能是造成毒株序列差異的主要原因[39]。

在相同的養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)管理條件下，2013-2016年間廣西沿海WSSV陽性率呈先下降后上升趨勢，而IHHNV陽性率呈顯著下降趨勢。本研究認為苗種質量問題是造成2種病毒變化趨勢不一的主要原因。蝦苗攜帶病毒的陽性率一定程度上影響了中成蝦攜帶病毒的陽性率。2013年蝦苗WSSV陽性率顯著小于IHHNV陽性率，因而中成蝦WSSV陽性率也小于IHHNV陽性率；而2014-2016年蝦苗WSSV陽性率顯著大于IHHNV的陽性率，所以在中成蝦樣品WSSV陽性率為13.2 %～41.9 %的同時，IHHNV陽性率不高于4.3 %。目前，廣西沿海凡納濱對蝦蝦苗來源比較復雜，親本主要由國外引進，蝦苗來源于廣東省、海南省及臺灣省等地。苗種產(chǎn)地未開展病原檢疫工作，一些攜帶病毒的蝦苗直接應用于生產(chǎn)，使對蝦疾病防控難度加大。凡納濱對蝦的病毒病尚無有效的藥物治療措施[9]。因此，建議除有關部門須加強對親蝦及蝦苗的病原檢疫工作外，養(yǎng)殖戶應購買病毒檢疫合格的蝦苗以減少對蝦養(yǎng)殖的風險。

本研究中，2013-2016年廣西沿海凡納濱對蝦WSSV和IHHNV陽性檢出率與采樣月份(季節(jié))之間未見明顯規(guī)律，與部分文獻研究結果不符，如：孟加拉[16]和印度斑節(jié)對蝦[17]WSSV陽性率在雨季較高，在水質穩(wěn)定的冬季較低；童桂香等[9]的研究表明，2010-2012年廣西養(yǎng)殖凡納濱對蝦IHHNV陽性率在暴雨臺風天較多的9月明顯比5月高；Chai等[42]發(fā)現(xiàn)，IHHNV的流行與水溫、鹽度和pH有一定的相關性。本研究認為病毒攜帶與否主要取決于蝦苗階段是否感染病毒，或養(yǎng)殖水環(huán)境(包括餌料及浮游生物等)是否被病毒污染，因為原本不攜帶病毒的對蝦可通過攝食被病毒污染的餌料、浮游生物或病蝦排泄物感染病毒[22, 30]。一些月份陽性檢出率較低的原因可能是因為被檢樣品其苗種階段未感染病毒或其水環(huán)境未被病毒污染，而一些月份陽性檢出率較高可能有以下原因：如被檢樣品在其苗種階段已攜帶病毒；通過餌料生物、浮游生物或帶病蝦的排泄物患病[22]；對蝦養(yǎng)殖密度過大或暴雨臺風等惡劣天氣引起水質因子劇烈動蕩導致病毒在養(yǎng)殖群體中傳播速度加快等[35-36, 43]。

4 結 論

2013-2016年，WSSV在廣西凡納濱對蝦主要養(yǎng)殖區(qū)依然有不同程度的流行，其檢出陽性率在2013、2015和2016年以欽州為最高，2014年北海最高；蝦苗WSSV陽性率顯著小于中成蝦陽性率。4年間，IHHNV陽性率呈逐年下降趨勢，2013年以欽州為最高，2015及2016年北海最高，2016年3個監(jiān)測區(qū)IHHNV檢測均為陰性。蝦苗總陽性率顯著小于中成蝦總陽性率。2013-2016年，同時攜帶WSSV和IHHNV的樣品所占比例呈顯著減少趨勢。

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