楊磊， 鄭金旭， 史小東， 錢海， 孫金玲

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

肺動脈高壓是多因素所致的一種病理生理狀態(tài)，包含5種臨床亞組，其預(yù)后不良。慢性低氧所致肺動脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension，HPH)是肺動脈高壓中最常見的亞組之一，其發(fā)病機(jī)制與肺動脈中層平滑肌細(xì)胞異常增殖引起的肺血管重塑有關(guān)[1]。研究揭示，HIF-2α、Wnt、TGF和MAPKs等多種信號通路參與肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMC)增殖和肺血管重塑，但針對HPH仍缺乏有效的治療藥物[2-5]。近來文獻(xiàn)報道m(xù)TOR信號途徑也與PASMC增殖有關(guān)，慢性低氧啟動mTOR活化，通過磷酸化激活下游關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子eIF2α，進(jìn)一步增加c-myc表達(dá)，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞過度增殖[6]。

丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)是丹參酮ⅡA的水溶性衍生物，是中藥丹參的主要有效成分之一。研究提示STS可改善肺血管重塑，降低肺動脈壓力，從而治療慢性低氧肺動脈高壓模型大鼠[7]。也有臨床研究結(jié)果表明，STS可改善肺動脈高壓患者的臨床癥狀，降低肺動脈壓力[8]，但其具體作用機(jī)制尚未明確。故本研究通過建立PASMC缺氧模型并予STS干預(yù)，檢測細(xì)胞內(nèi)mTOR和eIF2α蛋白的表達(dá)，觀察其對低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMC增殖的影響，進(jìn)一步探討STS治療肺動脈高壓的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠PASMC購于賽齊(上海)生物工程有限公司(貨號CBR130556)；STS凍干粉(成都瑞芬思生物科技有限公司)；雷帕霉素(RAM)，CCK-8試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；mTOR抗體、p-mTOR抗體及c-myc抗體(美國Cell Signaling Technology)；eIF2α抗體、p-eIF2α抗體(英國Abcam公司)；β-肌動蛋白抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(上海博彩生物公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；DEPC原液(上海生工生物工程有限公司)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(日本TaKaRa公司)。倒置光學(xué)顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；DU800核酸蛋白定量儀(美國Beckman公司)；DNA Engine普通PCR儀及CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞分組及給藥

取PASMC傳代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中施加干預(yù)時用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基作為基質(zhì)。在驗(yàn)證STS抑制低氧誘導(dǎo)的PASMC增殖實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為常氧組，常氧+STS組(5、10、20 ng/mL)、低氧組(3%O2)、低氧+STS組(5、10、20 ng/mL)。在STS作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞通路實(shí)驗(yàn))中，行熒光定量PCR檢測時，將PASMC分為常氧組、低氧組、低氧+STS組(10 ng/mL)；行蛋白質(zhì)印跡檢測時，將PASMC分為常氧組、低氧組、低氧+STS組(10 ng/mL)、低氧+RAM組(20 nmol/L)。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

待PASMC生長至80%～90%時，將其消化重懸，以5×103/mL密度接種于48孔板內(nèi)培養(yǎng)；每組設(shè)5個復(fù)孔(分組見“1.2”驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))。培養(yǎng)60 h后用CCK-8試劑盒測定波長450 nm處各孔D值，代表細(xì)胞的相對增殖率。

1.4 熒光定量PCR檢測大鼠PASMC中mTOR、eIF2α和c-myc mRNA的表達(dá)

取PASMC，去除培養(yǎng)基；用Trizol法提取總RNA，在紫外分光光度計下定量；反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用SYBR-Green法行熒光定量PCR。大鼠eIF2α引物正義鏈序列：5′-GGACAAATGGAAGTATGGGATG-3′，反義鏈序列5′-CAAGAGAGAGCCAGTGTAATGC-3′。大鼠mTOR引物正義鏈序列: 5′-ATCCAGACCCTGACCCAAAC-3′，反義鏈序列：5′-TCCACCCACTTCCTCATCTC-3′。c-myc引物正義鏈序列：5′-TGTCCGTTCAAGCAGATGAG-3′，反義鏈序列：5′-GGGTCAGTTTATGCACCAGA-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，擴(kuò)增40個循環(huán)；運(yùn)用熔解曲線程序以鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。數(shù)據(jù)采用相對定量的ΔCt法處理，以β-肌動蛋白對mTOR、eIF2α和c-myc mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。

1.5 免疫印跡法測定p-mTOR、mTOR、p-eIF2α、eIF2α、c-myc蛋白的表達(dá)

取PASMC，加入預(yù)冷PBS洗滌3次；充分吸盡殘余液體，加入100 ∶1配置的蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，搖床搖勻置于冰上裂解30 min；刮取細(xì)胞碎片，于4 ℃以12 000×g離心30 min；取上清液進(jìn)行蛋白定量；加入相同體積的2×SDS-上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min；再超聲破碎細(xì)胞10 s。取40 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳1.5 h；200 mA轉(zhuǎn)移90 min至PVDF薄膜；封閉液中封閉1 h；加入一抗，mTOR、p-mTOR、eIF2α、p-eIF2α及c-myc抗體(稀釋比均1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜；洗膜3次，10 min/次；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG抗體(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；顯色液顯色，半定量分析顯影條帶。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率的比較

與常氧組相比，低氧組細(xì)胞增殖率明顯升高(P<0.05)；與低氧組相比，低氧+STS(5、10、20 ng/mL)細(xì)胞增殖率呈濃度依賴性降低(P<0.05)，尤其藥物濃度達(dá)20 ng/mL時，細(xì)胞增殖水平明顯降低。與常氧組相比，常氧+STS(5、10 ng/mL)細(xì)胞增殖水平無明顯降低(P>0.05)，但濃度達(dá)20 ng/mL時，細(xì)胞增殖水平顯著下降(P<0.05)，考慮為細(xì)胞毒性作用，故選用10 ng/mL STS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

a：P<0.05，與常氧組比較；b：P<0.05，與低氧組比較

2.2 各組細(xì)胞mTOR、eIF2α、c-myc mRNA的表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組mTOR、eIF2α和c-myc mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，低氧+STS組3種mRNA相對表達(dá)量較低氧組明顯降低(P<0.05)；由此表明，STS處理對于PASMC的mTOR、eIF2α、c-myc mRNA表達(dá)有顯著抑制作用。見圖2。

a：P<0.05，與常氧組比較；b：P<0.05，與低氧組比較

2.3 各組細(xì)胞中mTOR、p-mTOR、eIF2α、p-eIF2α、c-myc蛋白的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組細(xì)胞中p-mTOR、mTOR、p-eIF2α、eIF2α和c-myc蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與低氧組相比，低氧+STS組和低氧+RAM組細(xì)胞中p-mTOR、mTOR、p-eIF2α、eIF2α和c-myc蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)。低氧+STS組與低氧+RAM組間各蛋白表達(dá)均無明顯差異(P>0.05)。由此表明，STS干預(yù)能夠抑制PASMC中mTOR、eIF2α、c-myc的表達(dá)，與雷帕霉素的效果類似，見圖3。

a：P<0.05，與常氧組比較；b：P<0.05，與低氧組比較

3 討論

丹參酮ⅡA作為丹參中的一種提取成分，其水溶性STS在臨床中多用于治療心血管疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化等[9]。丹參酮ⅡA具有抑制血小板黏附、聚集，抗血栓作用，還具有抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺氧、改善血管平滑肌功能等作用[10]。目前認(rèn)為肺動脈高壓發(fā)病與遠(yuǎn)端肺動脈血管中層的PASMC異常增殖導(dǎo)致的肺血管重塑有關(guān)[1]。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)STS干預(yù)慢性低氧性肺動脈高壓大鼠模型，能夠抑制PASMC增殖，改善肺血管重塑，降低肺動脈壓力；Wang等[12]通過構(gòu)建低氧性肺動脈高壓大鼠和野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓模型大鼠，并予STS干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌經(jīng)典瞬時受體電位蛋白(TRPC)1、6表達(dá)下調(diào)，而平滑肌細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度及鈣池操縱性鈣內(nèi)流增加，導(dǎo)致PASMC增殖及遷移抑制，且右心室收縮壓、右心室平均壓、右室壁厚度與左室壁+室間隔厚度之比均下降，肺血管重塑明顯改善。上述結(jié)果表明，STS能夠改善肺血管重塑，降低肺動脈壓力，對肺動脈高壓具有治療作用。本研究結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組細(xì)胞增殖水平顯著升高，說明細(xì)胞低氧模型構(gòu)建成功。與常氧組相比，STS+低氧組細(xì)胞增殖水平降低，由此表明，通過構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型，發(fā)現(xiàn)低氧可誘導(dǎo)大鼠PASMC增殖，而STS能夠抑制其增殖。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在外源性信號(絲裂原、營養(yǎng)、能量)刺激下，具有調(diào)控細(xì)胞代謝、生長、增殖及生存的作用[13]。mTOR有兩種不同的復(fù)合體，即mTORC1和mTORC2。mTORC1是細(xì)胞生長增殖的主要激活物，可通過磷酸化活化p70s6激酶1(S6K1)與4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)，進(jìn)一步激活核糖體蛋白6和eIF2E，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖[14-15]。關(guān)于mTOR信號通路功能的相關(guān)研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域[16]。也有文獻(xiàn)報道在特發(fā)性肺動脈高壓患者和動物肺動脈高壓模型中，mTOR具有促進(jìn)PASMC增殖的作用[17-18]。另有研究顯示在低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型大鼠及低氧誘導(dǎo)的PASMC模型中，mTOR明顯活化，呈過表達(dá)，且eIF2α、c-myc也呈高表達(dá)；再通過雷帕霉素和siRNA敲除mTOR及eIF2α處理PASMC可抑制PASMC增殖及c-myc表達(dá)[6]。本研究通過細(xì)胞低氧模型檢測mTOR mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示低氧誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的PASMC中mTOR活化。由此提示，mTOR在PASMC增殖中過度活化，這可能是低氧性肺動脈高壓肺血管重塑的機(jī)制之一。為進(jìn)一步證實(shí)STS是否具有抑制mTOR活性的作用，本研究設(shè)計了低氧+雷帕霉素組作為陽性對照，結(jié)果顯示STS與雷帕霉干預(yù)后mTOR表達(dá)無顯著差異。因此，本研究揭示STS可通過降低mTOR表達(dá)，進(jìn)而抑制PASMC增殖。

本研究結(jié)果提示，eIF2α作為mTOR的下游靶分子，可能在低氧性肺動脈高壓的PASMC增殖過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。給予STS處理并以雷帕霉素作陽性對照后發(fā)現(xiàn)，STS能夠抑制PASMC增殖的同時，還減少了p-eIF2α的表達(dá)。當(dāng)然，除了eIF2α，其他起始延長因子eIF也與mTOR信號通路相關(guān)，如mTOR結(jié)合eIF3可以促進(jìn)s6k的活化[15, 19]；因此，是否還有其他eIF參與還有待進(jìn)一步研究。c-myc活化是血管平滑肌細(xì)胞增殖的起始之一，血管損傷時其表達(dá)異常[20]。本研究中，低氧誘導(dǎo)PASMC中c-myc表達(dá)上調(diào)，而STS通過抑制mTOR或eIF2α進(jìn)一步下調(diào)c-myc的表達(dá)。綜上所述，丹參酮可以抑制PASMC的增殖，其機(jī)制可能是通過抑制低氧誘導(dǎo)的mTOR/eIF2α信號通路，進(jìn)一步抑制c-myc的表達(dá)而發(fā)揮作用。

[ 1 ] Sakao S, Tatsumi K. Vascular remodeling in pulmonary arterial hypertension: multiple cancer-like pathways and possible treatment modalities[J]. Int J Cardiol, 2011, 147(1):4-12.

[ 2 ] Raghavan A, Zhou G, Zhou Q, et al. Hypoxia-induced pulmonary arterial smooth muscle cell proliferation is controlled by forkhead box M1[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012, 46(4):431-436.

[ 3 ] de Jesus Perez V, Yuan K, Alastalo TP, et al. Targeting the Wnt signaling pathways in pulmonary arterial hypertension[J]. Drug Discov Today, 2014, 19(8): 1270-1276.

[ 4 ] Christopher L, Michael R, Zhong J, et al. The interaction of endothelin-1 and TGF-β1mediates vascular cell remodeling[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e73399.

[ 5 ] Karelina K, Liu Y, Alzate-Correa D, et al. Mitogen and stress-activated kinases 1/2 regulate ischemia-induced hippocampal progenitor cell proliferation and neurogenesis[J]. Neuroscience, 2015, 285: 292-302.

[ 6 ] Wang A, Li X, Yang Y, et al. A critical role of the mTOR/eIF2α pathway in hypoxia-induced pulmonary hypertension[J]. PLoS One, 2015, 10(6): e0130806.

[ 7 ] Zheng L, Liu M, Wei M, et al. Tanshinone ⅡA attenuates hypoxic pulmonary hypertension via modulating KV currents[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2015, 205: 120-128.

[ 8 ] Wang J, Lu W, Wang W, et al. Promising therapeutic effects of sodium tanshinone ⅡA sulfonate towards pulmonary arterial hypertension in patients[J]. J Thorac Dis, 2013, 5(2): 169-172.

[ 9 ] Xu S, Liu P. Tanshinone Ⅱ-A: new perspectives for old remedies[J]. Expert Opin Ther Pat, 2013, 23(2): 149-153.

[10] Gao S, Liu Z, Li H, et al. Cardiovascular actions and therapeutic potential of tanshinone ⅡA[J]. Atherosclerosis, 2012, 220(1): 3-10.

[11] Jiang Q, Lu W, Yang K, et al. Sodium tanshinone ⅡA sulfonate inhibits hypoxia-induced enhancement of SOCE in pulmonary arterial smooth muscle cells via the PKG-PPAR-γ signaling axis[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2016, 311(1): C136-C149.

[12] Wang J, Jiang Q, Wan L, et al. Sodium tanshinone ⅡA sulfonate inhibits canonical transient receptor potential expression in pulmonary arterial smooth muscle from pulmonary hypertensive rats[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48(1): 125-134.

[13] Laplante M, Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease[J]. Cell, 2012, 149(2): 274-293.

[14] Liu T, Yacoub R, Taliaferrosmith LD, et al. Combinatorial effects of lapatinib and rapamycin in triple-negative breast cancer cells[J]. Mol Cancer Ther, 2011, 10(8): 1460-1469.

[15] Eckerdt F, Beauchamp E, Bell J, et al. Regulatory effects of a Mnk2-eIF4E feedback loop during mTORC1 targeting of human medulloblastoma cells[J]. Oncotarget, 2014, 5(18): 8442-8451.

[16] Evangelisti C, Ricci F, Tazzari P, et al. Targeted inhibition of mTORC1 and mTORC2 by active-site mTOR inhibitors has cytotoxic effects in t-cell acute lymphoblastic leukemia[J]. Leukemia, 2011, 25(5): 781-791.

[17] Wang W, Liu J, Ma A, et al. mTORC1 is involved in hypoxia-induced pulmonary hypertension through the activation of Notch3[J]. J Cell Physiol, 2014, 229(12): 2117-2125.

[18] Houssaini A, Abid S, Mouraret N, et al. Rapamycin reverses pulmonary artery smooth muscle cell proliferation in pulmonary hypertension[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48(5): 568-577.

[19] Ahlemann M, Zeidler R, Lang S, et al. Carcinoma-associated eIF3i overexpression facilitates mTOR-dependent growth transformation[J]. Mol Carcinog, 2006, 45(12): 957-967.

[20] Sun LQ, Cairns MJ, Gerlach WL, et al. Suppression of smooth muscle cell proliferation by a c-myc RNA-cleaving deoxyribozyme[J]. J Biol Chem, 1999, 274(24): 17236-17241.