譚克， 張建新， 黨勝春

(江蘇大學附屬醫(yī)院普外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)并發(fā)心臟損害極為罕見，主要表現(xiàn)為心肌酶譜的改變、心功能降低、心律失常、心源性休克、中毒性心肌炎、心肌梗死等，甚至可導致心臟驟停[1]。心臟代償失調會導致SAP很高的致死率，其潛在機制尚未明確[2]。SAP病程的發(fā)展和炎癥細胞有著緊密的聯(lián)系，炎癥發(fā)生時，巨噬細胞、淋巴細胞及中性粒細胞等迅速聚集，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性細胞因子的快速產(chǎn)生和釋放激活了炎癥通路，通過干擾細胞內(nèi)Ca2+的平衡，引起心肌代償失調、心肌功能紊亂，最終導致心肌細胞凋亡[3-4]。TNF-α是SAP所致心肌損傷發(fā)生發(fā)展的最初始的啟動事件之一[5]。IL-6參與了SAP合并心功能障礙的發(fā)生[6-7]。因此控制巨噬細胞在SAP時的炎癥反應成為我們研究的關注點。研究發(fā)現(xiàn)[8]氯膦酸二鈉脂質體(clodronate liposome, LC)可以選擇性去除巨噬細胞，在SAP多器官損傷中具有重要作用。本研究擬探討LC對SAP大鼠心肌損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

48只實驗性健康雄性SD大鼠，體重255～290 g，購自江蘇大學； IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(Invitrogen公司)。?；悄懰徕c(Sigma公司)。

1.2 制備LC

參照文獻[9]制作脂質體包裹的氯膦酸二鈉，其包封率及濃度利用紫外分光光度計進行測量，測得包封率約為6%。

1.3 動物模型及實驗分組

大鼠隨機分為3組，分別為假手術組、SAP組及SAP+LC組。每組又分為術后2、6 h兩個時間點，各8只。SAP組和SAP+LC組大鼠予以胰腺包膜下緩慢注射5%?；悄懰徕c(2 mL/kg體重)，制備SAP模型[10-11]。假手術組開腹操作后，均勻胰腺被膜下注射0.9%生理鹽水；SAP組在制備SAP模型后，使用5 mL注射器抽取空白脂質體(4 mL/kg體重)，從大鼠尾靜脈緩慢勻速注射；SAP+LC組于制備SAP模型后，立即從大鼠尾靜脈勻速緩慢注射LC(4 mL/kg體重)。各組大鼠分別于術后2、6 h取材。

1.4 指標測定

1.4.1 IL-6、淀粉酶、TNF-α的測定 分別于制模后2、6 h脫頸處死各組大鼠，緩慢取腸系膜上靜脈血5 mL，3 000 r/min離心，取上層血清通過全自動生化分析儀測定淀粉酶含量[12]。同時按照ELISA試劑盒說明書測定IL-6、TNF-α的含量。

1.4.2 HE染色觀察心肌組織 處死大鼠后，取出大鼠心臟組織2 cm×2 cm左右的標本，用4%甲醛溶液固定后，常規(guī)進行切片，HE染色。參照文獻[13]，心肌細胞變性、壞死等按占心臟組織的范圍分別記0.5分(輕微)，1分(輕度)，2分(中度)，3分(重度)，4分(極重度)，請專業(yè)醫(yī)師進行病理學評分。

1.4.3 普魯士藍染色觀察心肌細胞間巨噬細胞數(shù)量 取心臟組織標本，用40 g/L的多聚甲醛固定，切片，使用普魯士藍染色液染色25 min，蒸餾水沖洗，核固紅染色2 min，沖洗、脫水、封固。顯微鏡下觀察心肌內(nèi)吞噬含鐵血黃素的藍染巨噬細胞數(shù)量。

1.4.4 免疫組化法觀察絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在大鼠心肌組織中的表達 取心肌標本后切片、脫蠟、抗原修復、血清封閉、加入一抗MAPK單克隆抗體(1 ∶200)，加入二抗生物素化兔抗山羊IgG。染色完成后由病理科醫(yī)生在顯微鏡下進行半定量分析，參照文獻[14]，免疫組織化學反應評分=陽性細胞數(shù)分級×陽性細胞光密度。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 LC治療降低SAP大鼠血清淀粉酶、IL-6及TNF-α的含量

在制模成功后2、6 h，SAP組和SAP+LC組的淀粉酶、IL-6以及TNF-α含量明顯高于假手術組(P<0.05)；SAP+LC組明顯低于SAP組(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與SAP組比較

2.2 LC治療改善SAP大鼠心肌病理損傷

假手術組大鼠2、6 h心肌細胞清晰可見，未見炎癥細胞。SAP組大鼠2 h心肌細胞間可見少量炎性細胞浸潤，少量心肌細胞結構模糊；6 h組心肌細胞間可見大量炎癥細胞，心肌纖維明顯退化，大多數(shù)心肌纖維結構消失，心肌膜破壞以及血管充血。SAP+LC組大鼠2 h心肌細胞間可見少量炎癥細胞，心肌細胞形態(tài)基本正常；6 h組可見心肌細胞間有少量的炎性細胞，但比2 h組更多，部分心肌細胞充血水腫，一些心肌纖維失去了橫紋。SAP+LC組的心肌病理情況得到改善，炎癥細胞明顯減少。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)(HE染色×100)

假手術組2 h和6 h時心肌病理學評分正常，SAP組和SAP+LC組2 h和6 h的心肌病理學評分明顯高于假手術組(P<0.05)；SAP+LC組2 h和6 h心肌的病理學評分比SAP組明顯降低(P<0.05)。見圖3。

2.3 LC治療減少SAP大鼠心肌細胞間巨噬細胞數(shù)量

假手術組大鼠術后2、6 h心肌細胞未見明顯改變，普魯士藍染色未見藍染細胞；SAP組的心肌細胞間出現(xiàn)梭形的藍染細胞，細胞形狀較大，為吞噬了鐵顆粒的巨噬細胞，2 h可見少量的藍染細胞，6 h可見大量的藍染細胞。SAP+LC組大鼠2 h心肌細胞間可見零星藍染細胞，6 h組可見少量藍染細胞。見圖4。

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與SAP組比較

圖4 大鼠心肌組織巨噬細胞(普魯士藍染色×100)

2.4 LC治療降低SAP大鼠心肌MAPK的表達

免疫組化結果顯示，假手術組的MAPK表達明顯低于SAP組和SAP+LC組，SAP+LC組MAPK表達明顯低于SAP組(圖5)。SAP組和SAP+LC組2 h和6 h免疫組化評分明顯高于假手術組(P<0.05)，SAP+LC組明顯低于SAP組(P<0.05)。見圖6。

圖5 免疫組化檢測大鼠心肌MAPK的表達(×100)

a：P<0.05，與假手術組比較; b：P<0.05，與SAP組比較

3 討論

巨噬細胞的浸潤與激活是SAP發(fā)生的始動因素，巨噬細胞和心肌細胞分泌的TNF-α可誘導炎癥通道的激活。炎癥反應產(chǎn)生各種補體因子、一氧化氮合成酶、細胞黏附分子、血小板活化因子和一些白細胞介素(如IL-6)，在SAP早期發(fā)病機制中起關鍵作用[15]。SAP大鼠早期血清TNF-α明顯升高，TNF-α在心肌的局部升高可以直接影響心臟的功能，導致肌質網(wǎng)Ca2+釋放下降，從而減少細胞內(nèi)Ca2+濃度，導致低血壓、休克、心衰等晚期效應。IL-6可以由許多類型細胞產(chǎn)生，其水平高低可以反映SAP的嚴重程度。過度激活的炎癥反應在SAP發(fā)展過程中起核心作用，促炎和抗炎反應失衡則可導致器官功能障礙、循環(huán)衰竭乃至死亡。而MAPK是介導炎癥反應的重要信號分子，活化的MAPK可以促進單核/巨噬細胞、中性粒細胞的過度活化[16]，可以將細胞外的信號快速地傳遞給細胞核，介導各種細胞因子的轉錄激活，在細胞生長、炎癥擴散等過程中發(fā)揮重要作用。許多研究表明，抑制心臟炎癥過程對減輕心臟功能障礙有益[17]，因此研究MAPK通路具有重要意義。

本實驗結果表明，LC誘導SAP大鼠巨噬細胞的凋亡，減少細胞因子及炎癥介質的釋放。SAP大鼠血清中淀粉酶、TNF-α以及IL-6的含量在LC作用下明顯下降，炎癥因子減少后，光鏡下心肌組織的病理損傷得到明顯的改善。

TNF-α、IL-6主要由M1型巨噬細胞生成，所以我們猜測LC可以選擇性清除M1型巨噬細胞。免疫組化表明LC降低了SAP大鼠MAPK的表達從而防止炎癥進一步擴大，對防治SAP心肌組織損傷起積極作用。有研究表明TNF-α可以激活心肌MAPK通路[18]，我們推測心肌組織MAPK的降低可能也與TNF-α的減少有關，從而沒有導致炎癥級聯(lián)放大。LC抑制MAPK通路的具體原因還要進一步研究。

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