王飛， 馮奇， 秦杰， 李婉， 盧春

(南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系， 江蘇 南京 211166)

高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)于1973年被發(fā)現(xiàn)，因其特殊的溶解性和在SDS-PAGE中的高遷移率而得名。HMG蛋白是含量僅次于組蛋白的染色質(zhì)蛋白，分布在細胞核內(nèi)，主要行使調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能；此外，它還參與轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重組和DNA修復(fù)等細胞生物學(xué)過程[1-2]。HMG蛋白根據(jù)其同源性可進一步分為HMGA、HMGB、HMGN 3個家族[3]，其中HMGB家族的HMGB1和HMGB2具有很高的同源性。研究顯示，HMGB1蛋白參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能及炎癥反應(yīng)，促進多種腫瘤形成與血管生成[4-5]。近來研究發(fā)現(xiàn)HMGB2在乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肝癌[6]等多種腫瘤中呈高表達，且在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[7-9]。啟動子是具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，位于基因5′端上游，具有可以與反式作用因子結(jié)合的順式作用元件結(jié)構(gòu)。啟動子就像“開關(guān)”，能夠活化RNA聚合酶并使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄，其本身并不影響基因的表達，而是通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而控制基因轉(zhuǎn)錄起始[10-14]。

本研究擬構(gòu)建含有HMGB2啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，并對其進行功能活性鑒定。同時，通過軟件分析預(yù)測可能與HMGB2啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，為進一步研究調(diào)控HMGB2基因轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細胞

pGL3-Basic、pCMV6-Entry-C-Flag、pCMV6-Entry-C-Flag-p53和海腎熒光素酶報告質(zhì)粒pRL-TK為本實驗室保存。本實驗所使用的細胞包括人胚腎上皮細胞(293T細胞)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，分別培養(yǎng)在含有10%和20%血清(美國Gibco公司)的DMEM(美國Gibco公司)中；培養(yǎng)基中含10 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，所有細胞均培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2 試劑

本實驗所用的PCR引物由南京擎科生物科技有限公司合成；PCR高保真酶(Fanta酶)購自南京諾唯贊科技有限公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒及感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒(美國Omega公司)；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；T4DNA連接酶(美國Thermo Scientific公司)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；Dual-Glo Luciferase Assay System(美國Promega公司)；p53抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自南京巴傲得生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全基因組DNA的提取 提取HUVECs的全基因組DNA作為HMGB2啟動子區(qū)域序列PCR擴增的模板。首先，選取匯合度為80%的HUVECs，經(jīng)胰酶消化后，用含有20%血清的完全DMEM終止消化，室溫800×g離心5 min，棄上清液；PBS重懸后再次離心棄上清液，根據(jù)血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取HUVECs基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增HMGB2啟動子序列 在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中查詢HMGB2啟動子序列，設(shè)計PCR擴增引物。上游引物：5′-CGGGGTACCACCAAAGAGCATAGTCTTAACATGTGCCAA-3′(下劃線部分為保護性堿基，斜體部分為KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識別序列)，下游引物：5′-CCGCTCGAGCC-CCAAATGCCGCTCGC-3′(下劃線部分為保護性堿基，斜體部分為XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識別序列)。以提取的HUVECs全基因組DNA為模版，PCR擴增HMGB2啟動子序列，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶在正確的位置后，進行切膠回收純化。

1.3.3 pGL3-HMGB2-promoter質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將上述切膠回收產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒分別用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化和T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于具有氨芐西林抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，隨機挑選單克隆菌落于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)、大量擴增并提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，同時，測定核酸序列，并利用APE軟件比對測序結(jié)果。

1.3.4 蟲熒光素酶報告實驗檢測p53對HMGB2啟動子活性的影響 將293T細胞接種在48孔板中，次日，使用LipofectamineTM2000將pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒、pGL3-Basic空載體分別與pCMV6-Entry-C-Flag-p53、pCMV6-Entry-C-Flag以及內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入293T細胞，pCMV6-Entry-C-Flag-p53質(zhì)粒與空載質(zhì)粒pCMV6-Entry-C-Flag以及pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒與其空載質(zhì)粒pGL3-Basic的質(zhì)量比為4 ∶1。24 h后，根據(jù)Dual-Glo Luciferase Assay System試劑盒說明書檢測相應(yīng)組別的熒光素酶活性，每組相對熒光素酶活性的值等于每組中每個獨立實驗的蟲熒光素酶與海腎熒光素酶檢測值比值的平均值。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測p53蛋白的表達 收集“1.3.4”中重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter分別共轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry-C-Flag-p53和pCMV6-Entry-C-Flag的293T細胞，提取總蛋白，取100 μg樣品進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜；經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h后，將PVDF膜孵育在p53和內(nèi)參GAPDH的一抗中(稀釋比為1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次5 min。用相應(yīng)的二抗37 ℃孵育1 h后(稀釋比為1 ∶10 000)；TBST洗膜3次，每次5 min，于化學(xué)發(fā)光儀下顯影。

1.3.6 與HMGB2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測 將HMGB2啟動子序列輸入在線軟件PROMO(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)中，根據(jù)網(wǎng)站提示進行操作，輸出可以與HMGB2啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)資料，獲得HMGB2啟動子的范圍，為HMGB2 mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1 379 bp到下游+292 bp的位置。根據(jù)該序列設(shè)計擴增引物，以HUVECs全基因組DNA為模版進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增片段約1 684 bp，與目標(biāo)DNA長度一致(圖1)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：HMGB2基因啟動子擴增產(chǎn)物

對pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒進行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果可見2條特異性片段，分別約為4 817 bp(載體片段)和1 684 bp(HMGB2啟動子片段，圖2a)。重組質(zhì)粒測序比對結(jié)果顯示，插入的HMGB2啟動子序列與理論序列一致(圖2b)，表明pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter雙酶切產(chǎn)物;A: 重組質(zhì)粒pGL3-HMGB2-promoter的雙酶切鑒定；B: 重組質(zhì)粒部分測序結(jié)果

2.2 pGL3-HMGB2-promoter重組質(zhì)?；钚缘尿炞C

蟲熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，pGL3-HMGB2-promoter報告質(zhì)粒的活性明顯高于pGL3-Basic對照組(t=4.587，P<0.01，圖3)，表明pGL3-HMGB2-promoter質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性。

a：P<0.01，與pGL3-Basic比較

2.3 p53對HMGB2啟動子活性的影響

免疫印跡結(jié)果證實，pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉(zhuǎn)染組成功過表達p53；蟲熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，過表達p53的pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉(zhuǎn)染組重組質(zhì)粒的蟲熒光素酶活性明顯低于pGL3-HMGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag共轉(zhuǎn)染組(圖4)。由此進一步說明本實驗構(gòu)建的pGL3-HMGB2-promoter報告質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)錄活性。

2.4 與HMGB2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

運用在線軟件PROMO對HMGB2啟動子區(qū)域(-1 379 bp～+292 bp)進行分析，預(yù)測出72個可能與HMGB2啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，其中TFIID[16]、LEF-1[17-18]、POU2F2(Oct-2)[19]、NFI/CTF[20]、FOXP3[21]、STAT4[22]等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)(表1)。這些轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測為我們進一步探索調(diào)控HMBG2表達的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

表1 HMGB2啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的部分預(yù)測結(jié)果

1：pCMV6-Entry-C-Flag; 2:pCMV6-Entry-C-Flag-p53

3 討論

先前的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB2可與雌激素受體結(jié)合，競爭性抑制內(nèi)分泌治療藥物對乳腺癌的治療作用，促進乳腺癌的發(fā)展[9]。另外，HMGB2可以通過調(diào)控p53的表達增強腫瘤細胞的生存、侵襲能力以及對化療藥物的拮抗作用，從而促進骨肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展[23-24]。另有研究表明，HMGB2可以促進Oct4的小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)化，從而抑制其被磷酸化降解，進一步激活A(yù)KT通路，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[25]。

本研究擴增了HMGB2啟動子所在區(qū)域的DNA片段，成功構(gòu)建了含有HMGB2啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒。p53可通過結(jié)合HMGB2啟動子區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄[15]，本實驗所構(gòu)建的pGL3-HMGB2-promoter報告質(zhì)粒活性能夠被p53抑制，與之一致。該質(zhì)粒的構(gòu)建有助于尋找能夠與HMGB2啟動子結(jié)合并促進HMGB2表達的轉(zhuǎn)錄因子，進而闡明HMGB2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的具體分子機制。

通過在線軟件PROMO對HMGB2啟動子序列進行分析預(yù)測，獲得72個可能作用于HMGB2的轉(zhuǎn)錄因子，其中p53已被報道可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控HMGB2[15]。另外，預(yù)測結(jié)果中的許多轉(zhuǎn)錄因子可以與HMGB2直接結(jié)合，或者受HMGB2調(diào)控從而影響其行使轉(zhuǎn)錄功能。例如，HMGB2可以促進轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD-TFⅡA與其調(diào)控的目的基因的啟動子區(qū)結(jié)合從而促進下游基因的轉(zhuǎn)錄[26]。HMGB2可以促進轉(zhuǎn)錄因子Lef-1的表達及其與β-catenin復(fù)合物的形成，進而誘導(dǎo)下游基因的表達[17-18]。HMGB2還可以通過促進轉(zhuǎn)錄因子Oct2的表達，抑制正常B淋巴細胞的分化、維持B淋巴瘤細胞的存活導(dǎo)致B淋巴瘤的發(fā)生[19, 27]。這些轉(zhuǎn)錄因子是否能夠調(diào)控HMGB2轉(zhuǎn)錄，目前尚不清楚。我們下一步將以這些可能作用于HMGB2啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子為基礎(chǔ)，探究其在HMGB2轉(zhuǎn)錄過程中的作用，從而有助于闡明HMGB2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制。

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