路慶艷， 劉寶翠， 毛朝明， 董昕， 牟笑， 許鋮鋮， 鄭婷婷

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis， HT)是造成甲狀腺功能減退癥最常見的原因，其主要病理機(jī)制是大量淋巴細(xì)胞浸潤甲狀腺間質(zhì)并免疫損傷甲狀腺細(xì)胞[1]。小窩蛋白-1(Caveolin-1)是細(xì)胞膜上囊狀樣結(jié)構(gòu)小窩的主要蛋白，在正常甲狀腺上皮細(xì)胞中，主要位于細(xì)胞膜的頂端，維持甲狀腺激素的正常合成。先前的研究發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織中Caveolin-1的表達(dá)降低，尤其在淋巴浸潤嚴(yán)重的區(qū)域更為顯著[2-3]。近年來研究顯示，趨化因子在誘導(dǎo)橋本甲狀腺炎患者淋巴細(xì)胞浸潤的過程中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用[4-6]。本研究旨在構(gòu)建Caveolin-1基因RNA干擾慢病毒，探討其對人甲狀腺上皮細(xì)胞Nthy-ori 3趨化因子mRNA表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺上皮細(xì)胞系Nthy-ori 3-1購自ECACC細(xì)胞中心, 人胚腎上皮細(xì)胞293T、shRNA慢病毒載體pLKO.1、包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2均由上海中科院提供。兔抗人β-肌動蛋白抗體、兔抗人Caveolin-1抗體(CST公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；脫脂奶粉(恒天然有限公司)；RNA抽取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa公司); 2×含染料Taq預(yù)混PCR反應(yīng)試劑 (北京康潤誠業(yè)生物公司)；氨芐青霉素、嘌呤霉素，感受態(tài)大腸埃希菌DH5α、質(zhì)粒小抽試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；ECL發(fā)光液、全蛋白提取試劑盒、PVDF膜(美國Millipore公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Nthy-ori 3-1細(xì)胞和293T細(xì)胞分別在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pLKO.1-Caveolin-1的構(gòu)建 Caveolin-1特異性正、反義鏈shRNA(shCaveolin-1)序列由蘇州吉瑪基因有限公司設(shè)計并合成，正義鏈：5′-CCGGCCTTCACTGTGACGAAATACTCTCGAGAG-TATTTCGTCACAGTGAAGGTTTTTG-3′, 反義鏈：5′-AATTCAAAAACCTTCACTGTGACGAAATACTCTCG-AGAGTATTTCGTCACAGTGAAGG-3′。將單鏈引物序列退火成雙鏈Oligo干擾片段，與線性化的pLKO.1-嘌呤霉素的空載連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，涂布于含有氨芐抗性的LB瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取數(shù)個單克隆，進(jìn)行基因測序，提取重組質(zhì)粒，以備轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.2.3 慢病毒包裝及感染 293T細(xì)胞密度為70%時，將空載pLKO.1或目的基因質(zhì)粒Caveolin-1 shRNA與慢病毒包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48 h后，收集病毒液并感染Nthy-ori 3-1細(xì)胞。嘌呤霉素篩選出陽性細(xì)胞，分別命名為shMock組細(xì)胞(空載質(zhì)粒病毒感染)和shCaveolin-1組細(xì)胞(目的基因質(zhì)粒病毒感染)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，熒光實時定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡檢測病毒的感染效果。

1.2.4 qRT-PCR檢測兩組Nthy-ori 3-1細(xì)胞Caveolin-1和趨化因子的mRNA表達(dá) 細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用Trizol法提取總RNA。在37 ℃ 1 h、85 ℃ 15 s、4 ℃保存反應(yīng)條件下，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR引物由上海生工有限公司合成，各引物序列如下：GAPDH上游5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游5′- GGGTGGAATCATATTGGAACA -3′；Caveolin-1上游5′-TCAACCGCGACCCTAAACACC-3′，下游5′-TGAAATAGC TCAGAAGAGACA-3′；CXC趨化因子配體10(CXCL10)上游: 5′-CCACGTGTTGAGATCATTGC-3′,下游5′-CCTCTGTGTGGTCCATCCTT-3′；CC趨化因子配體20(CCL20)上游 5′-GTGGCTTTTCTGGAATGGAA-3′，下游 5′-GACAAGTCCAGTGAGGCACA-3′。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×含染料Taq預(yù)混PCR反應(yīng)試劑5 μL，引物1 μL(終濃度為2 μmol/L)，cDNA 4 μL。正常兩步法：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，進(jìn)行40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，所得結(jié)果用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測Caveolin-1的表達(dá) 收集經(jīng)0.25%胰酶消化后的兩組Nthy-ori 3-1細(xì)胞，250×g離心5 min，PBS重復(fù)洗滌2次。加入預(yù)冷的裂解液，冰上放置30 min，12 000×g離心3 min，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)100 ℃ 10 min變性后，取5 μg蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE分離，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入兔抗人Caveolin-1抗體(1 ∶1 000)，兔抗人β-肌動蛋白抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)，37 ℃孵育1h，PBST洗滌3次，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nthy-ori 3-1感染慢病毒后的細(xì)胞形態(tài)

測序正確后，用包裝好的慢病毒感染Nthy-ori 3-1細(xì)胞，嘌呤霉素連續(xù)篩選3天后，普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)shMock組和shCaveolin-1組細(xì)胞與正常甲狀腺上皮細(xì)胞相比，其形態(tài)變圓，生長速度減慢，但細(xì)胞狀態(tài)良好，可以正常傳代(圖1)。

2.2 shCaveolin-1慢病毒干擾效果的驗證

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與shMock組相比，shCaveolin-1組中Caveolin-1的mRNA水平明顯下調(diào)(t=19.55 ,P<0.01；圖2)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示， shCaveolin-1組中Caveolin-1的蛋白表達(dá)低于shMock組(圖3)。表明穩(wěn)定敲除Caveolin-1的甲狀腺上皮細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 倒置顯微鏡觀察甲狀腺上皮細(xì)胞形態(tài)(×20)

圖2 qRT-PCR檢測Nthy-ori 3-1細(xì)胞Caveolin-1的mRNA相對表達(dá)量

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測Nthy-ori 3-1細(xì)胞Caveolin-1的蛋白水平

2.3 敲減Caveolin-1后Nthy-ori 3-1細(xì)胞趨化因子mRNA表達(dá)升高

qRT-PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲減Caveolin-1的Nthy-ori 3-1細(xì)胞CXCL10和CCL20的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05，圖4)。

3 討論

橋本甲狀腺炎和Graves病是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病，以血清中產(chǎn)生高滴度抗促甲狀腺激素受體抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺過氧化物酶抗體等自身抗體為特征[7-8]。研究認(rèn)為，在易感基因及環(huán)境等因素作用下, 自身免疫耐受遭受破壞, 誘發(fā)大量淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致甲狀腺功能紊亂，是橋本甲狀腺炎發(fā)病的主要原因[5, 9-12], 但其具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

圖4 qRT-PCR檢測Nthy-ori 3-1細(xì)胞CXCL10和CCL20的mRNA水平

趨化因子是一種通過與相應(yīng)受體結(jié)合，吸引中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞到炎癥部位，參與炎癥反應(yīng)的低分子量分泌性蛋白。正常情況下，主要是由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，然而在一些促炎因子的作用下，甲狀腺上皮細(xì)胞也能分泌多種趨化因子[6]。 研究發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎患者外周血中CXCL10和CCL20水平顯著增高[13-15]。CXCL10主要在疾病的初始階段招募已活化的T淋巴細(xì)胞，啟動炎癥反應(yīng)[16]，CCL20可能參與趨化Th17細(xì)胞遷移、聚集至病變組織，加重炎癥損傷[17-18]。

最近研究報道，Caveolin-1通過自身的腳手架區(qū)域(scaffolding domain，CSD)調(diào)控一些趨化因子的表達(dá)[19-20]。Yamaguchi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人角質(zhì)形成細(xì)胞中Caveolin-1表達(dá)減少，導(dǎo)致趨化因子CXCL8、CXCL9及CCL20分泌增加，加重皮膚炎癥反應(yīng)。Tiwari等[20]研究顯示，給予吸煙誘導(dǎo)的肺損傷小鼠腹腔注射CSD肽，能夠顯著抑制肺泡上皮細(xì)胞中CXCL1和CXCL2的分泌，緩解肺損傷。最近研究表明，橋本甲狀腺炎患者組織中Caveolin-1 的表達(dá)降低[3-4]。我們的研究結(jié)果顯示，甲狀腺上皮細(xì)胞中Caveolin-1的表達(dá)減少，能夠顯著上調(diào)趨化因子CXCL10和CCL20的mRNA水平，初步提示Caveolin-1可能通過影響某些趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而參與橋本甲狀腺炎的病理過程。

在后續(xù)的實驗中，我們將進(jìn)一步研究Caveolin-1敲減的甲狀腺上皮細(xì)胞中其他相關(guān)趨化因子的表達(dá)及分泌情況，探討甲狀腺上皮細(xì)胞相關(guān)功能的改變，為橋本甲狀腺炎的免疫病理機(jī)制提供新的思路。

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