任露沛，王 鳳，范俊峰

(1北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100000)

二肽基肽酶IV(DPP4)是糖尿病治療的新靶點(diǎn)，可通過(guò)調(diào)節(jié)其活性來(lái)控制餐后血糖的濃度，腸促胰島素(GLP-1和GIP)是DPP4的天然底物，抑制DPP4活性，可防止腸促胰島素的降解，進(jìn)而有效降低餐后血糖濃度，因此DPP4被看作是治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶標(biāo)酶之一[1-2]。近年來(lái)，人們研究了動(dòng)植物來(lái)源的蛋白多肽(鮭魚(yú)、牛奶、雞蛋、燕麥、大米、大豆、小麥和莧菜種子)對(duì)DPP4的抑制活性[3-5]。此外，在體外研究中，牛奶全蛋白水解物、酪蛋白水解物、清蛋白水解物以及莧菜種子蛋白水解物均具有DPP4抑制活性，且大多數(shù)研究重點(diǎn)關(guān)注水解物中存在的功能性小肽(含2～8個(gè)氨基酸序列的肽)[6-7]。一般認(rèn)為小肽才具有生物活性，且更易于人體消化吸收，而氨基酸序列超過(guò)8個(gè)以上的肽在消化過(guò)程中可能會(huì)被進(jìn)一步水解[8]。

多肽經(jīng)口腔、胃進(jìn)入腸道，整個(gè)過(guò)程經(jīng)歷多種酶解環(huán)境。其中，對(duì)多肽具有酶解作用的酶主要是胰蛋白酶和胃蛋白酶，多肽在這些酶的作用下分解成分子量更小的肽以及氨基酸，其中多肽經(jīng)過(guò)口腔進(jìn)入胃部，pH值降為2左右，變化劇烈[9-10]。多肽的利用中，防止多肽的水解是關(guān)鍵，人們采用各種方法如加入糖類(lèi)、多元醇和明膠等去防止其水解。目前發(fā)現(xiàn)，一些礦質(zhì)元素與肽相互作用，一方面可以改變蛋白和肽的構(gòu)型或生物活性，另一方面可以改善礦質(zhì)元素的吸收性[11-12]。但是這種相互作用能否影響多肽的降解還需要深入研究。LQAFEPLR(LQ8)和EFLLAGNNK(EF9)是筆者從燕麥蛋白中獲得的長(zhǎng)鏈DPP4抑制肽。本文利用體外模擬胃腸消化模型，研究?jī)煞N多肽(LQ8和EF9)的鈣和鋁的螯合肽在胃腸消化環(huán)境的穩(wěn)定性，并測(cè)定體外模擬消化前后肽的紅外光譜和對(duì)DPP4的抑制活性。本研究不僅為金屬螯合肽的胃腸消化高耐受性提供理論基礎(chǔ)，還可以為研究金屬螯合肽促進(jìn)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)吸收提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

多肽EFLLAGNNK(EF9)與DPP4活性位點(diǎn)的結(jié)合能為(-9.1)，LQAFEPLR (LQ8)與DPP4的活性位點(diǎn)的結(jié)合能為(-8.8)，通過(guò)上海強(qiáng)耀生物有限公司合成這兩條多肽，EF9的純度 > 96.6%，LQ8的純度 > 99.0%，EF9分子量1 149.25Da，LQ8分子量1 099.23Da。胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶粉均購(gòu)自Sigma 公司；超純水由AquelixTM 5制備；其他檢測(cè)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

TD5A-WS臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LL-1 500真空冷凍干燥機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；Model 680酶標(biāo)儀，Bio-RAD；WH-2 型旋渦振蕩器(旋渦混合器)，常州華奧儀器制造有限公司。

1.3 多肽螯合物的制備

把EF9和LQ8按照 5%(w/v)的比例分別溶于超純水中，用檸檬酸和NaOH溶液將溶液pH調(diào)節(jié)到5.4，分別加入無(wú)水氯化鈣和無(wú)水氯化鋁(多肽∶Ca=2∶1；多肽∶Al = 2∶1)。溶液在55℃下攪拌1.5h，加入3倍體積的無(wú)水乙醇去除未螯合的鈣或鋁，得到LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ-Al和EF9-Al溶液。將得到的EF9-Ca、LQ8-Ca、EF9-Al和LQ-Al溶液，以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，將析出物分離冷凍干燥，采用EDTA 絡(luò)合滴定法，分別測(cè)定Ca和Al的螯合率。

螯合率(%)=V1/V2×100

(1)

式(1)中：V1為滴定螯合態(tài)鈣離子或鋁離子所消耗的EDTA溶液體積(mL)；V2為滴定鈣離子或鋁離子總量所消耗的EDTA溶液體積(mL)。

1.4 體外模擬胃腸道消化

體外模擬胃腸道消化水解參照王鳳[13]的方法進(jìn)行。分別取5 mg樣品(LQ8、EF9、LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ8-Al和EF9-Al)溶解于10 mL 0.03 mol/L NaCl(pH值2.0)，混合液在80℃水浴5 min后冷卻至室溫。以酶和多肽溶液的比例為1∶20(W/W)加入豬胃蛋白酶，在37℃恒溫水浴振蕩器水解，保持穩(wěn)定的pH為2.0，水解時(shí)間3 h。調(diào)節(jié)pH到7.5，以酶和多肽溶液比1∶20的比例加入胰蛋白酶和胰酶粉的混合物(1∶1 w/w 胰蛋白酶∶胰酶，提前溶解于0.1 N NaHCO3)，保持恒定pH值7.5和恒溫37℃水解持續(xù)3 h，在75℃水浴20 min終止反應(yīng)。將水解液離心(10 000×g，30 min)后取上清液凍干，干燥粉末在-20℃保存。水解后得到的樣品分別記為L(zhǎng)Q8-H、EF9-H、LQ8-HCa、EF9-HCa、LQ8-HAl和EF9-HAl。

1.5 DPP4抑制活性測(cè)定

DPP4活性檢測(cè)根據(jù)王鳳[13]的方法進(jìn)行。反應(yīng)在96孔板內(nèi)進(jìn)行，加入10μL DPP4(終濃度為100 ng/mL)，50μL發(fā)光底物Gly-Pro-pNA(終濃度為500μmol/L)，40μL待檢測(cè)的多肽樣品，所用的溶解液均為100 mmol/L Tris-buffer緩沖液(pH 8.0)，反應(yīng)在37℃下培養(yǎng)1.0h，酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)其吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少做3組平行。100% 酶活組將以上加樣品步驟換成加Tris-buffer緩沖液，加入量與樣品量一致；自身對(duì)照將以上加酶步驟換成Tris-buffer緩沖液，加入量與酶量一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用DPP4抑制性(%)和IC50值(DPP4抑制活性達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度，mg/mL)表示。

DPP4抑制性(%)=(樣品吸光值-自身對(duì)照吸光值)/(100% 酶活吸光值)× 100

(2)

1.6 紅外光譜檢測(cè)

采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，儀器預(yù)熱穩(wěn)定后，采用KBr可拆卸液體池加樣，掃描紅外吸收光譜，掃描范圍400～4 000cm-1，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)70，保存譜圖。采用點(diǎn)平滑、歸一化及基線(xiàn)校正等預(yù)處理方法對(duì)光譜進(jìn)行處理。將所得特征峰的面積比值作為坐標(biāo)，用Origin 8.0作圖。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)顯著性由SPSS處理，圖像繪制由GraphPad Prism 5.01和Origin 8.0完成。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽與金屬元素的螯合率

如圖1所示，多肽LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ8-Al和EF9-Al的螯合率分別為12.7%、9.0%、9.3%和12.3%，相比于天然多肽，LQ8和EF9與金屬元素的螯合率比較低。張美玲等[12]研究了大豆分離蛋白與鈣的螯合，終產(chǎn)物的螯合率達(dá)到了76.6%，遠(yuǎn)高于筆者研究的多肽與鈣的螯合率；崔瀟等[14]研究了羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原多肽與鎂離子的螯合，螯合率達(dá)到84.6%；劉永等[15]對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽鋅螯合物進(jìn)行了研究，螯合率為91.96%。LQ9和EF8都是短肽，羧基和氨基這些基團(tuán)含量少，可以螯合金屬的位點(diǎn)比較少，因此螯合率低。

圖1 LQ8和EF9與鈣和鋁的螯合率

2.2 LQ8和EF9及其金屬螯合物的DPP4抑制活性

如圖2所示，LQ8有很強(qiáng)的DPP4抑制活性，且抑制活性具有濃度依賴(lài)性，其IC50值為103.5μM，而研究發(fā)現(xiàn)，EF9的DPP4的抑制活性比較弱，在樣品濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，其抑制活性?xún)H為31%。LQ8與鈣螯合后，LQ8-Ca對(duì)DPP4的抑制活性與LQ8相比變化不大，IC50值為91.6μM；LQ8與鋁螯合后，LQ8-Al對(duì)DPP4的抑制活性顯著下降(P<0.05)，在樣品濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，其抑制活性?xún)H為57%。EF9-Ca對(duì)DPP4的抑制活性相對(duì)于EF9顯著升高(P<0.05)，但對(duì)DPP4的抑制活性仍然較低，在樣品濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，其抑制活性?xún)H為45%；EF9-Al對(duì)DPP4的抑制活性顯著升高，其IC50值為156μM。這些結(jié)果說(shuō)明，多肽與金屬元素螯合后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較大的變化，導(dǎo)致其活性發(fā)生改變。

圖2 多肽及多肽金屬螯合物體外模擬水解前后的DPP4抑制活性 注：DPP4的終濃度為100 ng/mL；底物的濃度為500μmol/L；多肽的終濃度為5.0、25、50、100、200和400μg/mL

2.3 LQ8和EF9及其金屬螯合物的紅外光譜

當(dāng)金屬離子與多肽氨基酸殘基結(jié)合后，其變化可以通過(guò)肽的羧酸酯和酰胺的特征紅外吸收峰的變化觀察出來(lái)[16-17]。圖3A和3B表示多肽及多肽鈣和多肽鋁紅外光譜圖。在3 285～3 347 cm-1處屬于酰胺A帶的N-H 收縮振動(dòng)峰，1 600～1 647cm-1之間出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰屬于酰胺I帶，是由蛋白多肽骨架C=O伸縮振動(dòng)所引起的，1 426～1 453 cm-1屬于多肽氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，由苯環(huán)骨架振動(dòng)造成的，1 027～1 088 cm-1處為C-O-C收縮振動(dòng)峰。LQ8和EF9分別在3 366 cm-1、3 321 cm-1處有吸收峰，當(dāng)LQ8和EF9分別與鈣和鋁螯合后，LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ8-Al和EF9-Al出峰位置都出現(xiàn)了遷移，吸收峰分別變?yōu)? 347cm-1、3 300cm-1、3 327 cm-1、3 285 cm-1，原因是因?yàn)殁}或鋁與蛋白螯合后，N-H伸縮振動(dòng)峰參與了氫鍵的形成[18]。在1 639 cm-1和1 620 cm-1處LQ8和EF9都出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰，兩種多肽分別和鈣螯合后，LQ8-Ca和EF9-Ca的吸收峰分別為1 647cm-1和1631 cm-1，說(shuō)明鈣與氨基有結(jié)合，并發(fā)生了紅移；兩種多肽分別與鋁螯合后，LQ8-Al和EF9-Al的吸收峰分別為1 621cm-1和1 600 cm-1，說(shuō)明鋁與氨基有結(jié)合，并向短波位移動(dòng)，這與Shi[19]報(bào)道的結(jié)果一致。

2.4 體外模擬水解前后LQ8和EF9及其金屬螯合物對(duì)DPP4的抑制活性

利用體外胃腸道模擬消化模型對(duì)LQ8、LQ8-Ca、LQ8-Al、EF9、EF9-Ca和EF9-Al進(jìn)行水解后，這6種多肽仍具有DPP4抑制活性，且對(duì)DPP4的抑制活性呈濃度依賴(lài)性。相比于LQ8，LQ8-H對(duì)DPP4的抑制活性顯著下降(P<0.05)，在樣品濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，其抑制活性?xún)H為37%；體外模擬水解對(duì)LQ8-HCa和LQ8-HAl的影響不大，LQ8-HCa對(duì)DPP4仍具有很高的抑制活性，其IC50值為97.6μM，LQ8-HAl對(duì)DPP4的抑制活性雖然不高，但相對(duì)于LQ8-Al的變化并不大。EF9-HCa和EF9-HAl對(duì)DPP4的抑制活性相對(duì)于水解前變化也不大，EF9-HCa和EF9-HAl在在樣品濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，對(duì)DPP4的抑制率分別達(dá)到了41%和60%。LQ8和EF9兩種多肽經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，對(duì)DPP4的抑制活性顯著降低，原因是兩種多肽經(jīng)酶水解后，它們的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其活性降低；LQ8和EF9與鈣或鋁的螯合可以改變這兩種多肽的構(gòu)象，抑制其進(jìn)一步發(fā)生水解，保持多肽的活性[10]。

2.5 體外模擬水解前后LQ8和EF9及其金屬螯合物的紅外光譜圖

多肽及多肽的金屬螯合物經(jīng)體外模擬水解后，仍具有典型的蛋白吸收峰(圖3)。LQ8經(jīng)酶水解后，LQ8-H的C=O伸縮振動(dòng)峰由1 639cm-1移至1 637cm-1，向短波位移動(dòng)，且吸收峰加強(qiáng)，且LQ8-H在1 051cm-1處的C-O-C吸收峰消失；LQ8-HCa和LQ8-HAl的C=O伸縮振動(dòng)峰只發(fā)生了遷移，分別從1 647cm-1移動(dòng)至1 641cm-1和1 621cm-1移動(dòng)至1 619 cm-1。多肽EF9經(jīng)過(guò)體外模擬水解后，EF9-H的C=O伸縮振動(dòng)峰也發(fā)生了較大的變化，C=O伸縮振動(dòng)峰由1 620 cm-1移至1 616cm-1，向短波位移動(dòng)，與LQ8-H的不同的是，EF9-H的吸收峰變?nèi)酰籈F9-HCa和EF9-HAl的吸收峰與EF9-Ca和EF9-Al相比變化不大。

3 結(jié)論

多肽LQ8和EF9對(duì)DPP4都有抑制活性，但EF9的抑制活性不高，EF9螯合鈣或鋁之后，EF9-Ca和EF9-Al對(duì)DPP4的抑制活性顯著升高；LQ8和EF9被酶水解后，對(duì)DPP4的抑制活性顯著下降；LQ8和EF9與金屬元素螯合后，其水解產(chǎn)物L(fēng)Q8-HCa、LQ8-HAl、EF9-HCa和LQ8-HAl對(duì)DPP4的抑制活性基本保持不變；通過(guò)傅里葉紅外光譜發(fā)現(xiàn)，多肽金屬螯合物經(jīng)體外模擬水解后，其水解前后紅外光譜基本保持不變，而LQ8和EF9水解前后的紅外光譜變化較大。本研究表明，多肽LQ8和EF9螯合金屬元素后，其構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其對(duì)蛋白酶的耐受性和生物活性發(fā)生變化?！?/p>

圖3 多肽及多肽金屬螯合物體外模擬水解前后的紅外光譜圖

[1]李璀.靶向DPP4和PTP1B的Ⅱ型糖尿病藥物設(shè)計(jì)研究[D]. 華東理工大學(xué)，2011.

[2]陸菊明.DPP4抑制劑單藥治療和聯(lián)合治療方案及療效分析[J]. 藥品評(píng)價(jià)，2012(34)：31-36.

[3]Nongonierma A.B.，F(xiàn)itzgerald，R.J.Dipeptidyl peptidase iv inhibitory and antioxidative properties of milk protein-derived dipeptides and hydrolysates [J]. Peptides，2013，39(1)：157-163.

[4]Cavazos A.，Mejia E.G.D.Identification of bioactive peptides from cereal storage proteins and their potential role in prevention of chronic diseases [J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2013，12(4)：364-380.

[5]Velarde-Salcedo A.J.，Barrera-Pacheco A.，Lara-González S.，et al.In vitro，inhibition of dipeptidyl peptidase iv by peptides derived from the hydrolysis of amaranth proteins [J]. Food Chemistry，2013，136(2)：758-764.

[6]Lacroix I.M.E.，Li-Chan E.C.Y.Evaluation of the potential of dietary proteins as precursors of dipeptidyl peptidase DPP4 inhibitors by an in silico，approach [J]. Journal of Functional Foods，2012，4(2)：403-422.

[7]Nongonierma A.B.，F(xiàn)itzgerald R J.Susceptibility of milk protein-derived peptides to dipeptidyl peptidase iv (dpp-iv)hydrolysis [J]. Food Chemistry，2014，145(145C)，845-852.

[8]黎金.蕎麥多肽制備及其抗氧化活性研究[D]. 西北農(nóng)林大學(xué)，2009.

[9]趙力超，寧德山，龍梓祺，等.酪蛋白磷酸肽副產(chǎn)物中ACEI肽的分離鑒定及穩(wěn)定性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30(10)：52-57.

[10]杜芬，侯虎，趙玉然,等.鱈魚(yú)源金屬螯合肽體外模擬胃腸消化穩(wěn)定性研究[J].現(xiàn)代食品化學(xué)，2016，32(7)：33-38.

[11]高紅梅，桑宏慶，李淑賢.小麥肽-鋅螯合物的制備[J].飲料工業(yè)，2013，16(7)：23-26.

[12]張美玲，趙新淮.大豆蛋白水解物的酶法修飾及其亞鐵和鈣離子的螯合能力[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(12)：26-30.

[13]王鳳.燕麥多肽的結(jié)構(gòu)特征及DPP4抑制作用[M].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2016.

[14]崔瀟，江虹銳，劉小玲，等.響應(yīng)面法優(yōu)化羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原多肽螯合鎂的工藝條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34(15)：238-245.

[15]劉永，黎彬慶，韋壽蓮.羅非魚(yú)鱗膠原蛋白肽鋅螯合物制備工藝優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(4)：125-129.

[16]Mizuguchi M.，F(xiàn)ujisawa R.，Nara M.，et al.Fourier-transform infrared spectroscopic study of Ca2+-binding to osteocalcin[J].Calcified Tissue International，2001，69(6)：337-342.

[17]Nara M.，Morii H.，Tanokura M.Coordination to divalent cations by calcium-binding proteins studied by ftir spectroscopy [J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2013，1828(10)：2319-2327.

[18]Zhe P.，Hu H.，Kai Z.，et al.Effect of calcium-binding peptide from pacific cod (gadus macrocephalus)bone on calcium bioavailability in rats [J]. Food Chemistry，2017，221：373-378.

[19]Shi J.，Wang J.Interaction between metal cation and unnatural peptide backbone mediated by polarized water molecules：study of infrared spectroscopy and computations [J]. Journal of Physical Chemistry B，2014，118(43)：12336-12347.

[20]邵劍鋼，錢(qián)平，劉晉，等.小麥低聚肽的功能作用研究進(jìn)展及應(yīng)用前景展望[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2016，22(10)：72-74.

[21]李雪芬，杜斌，丁軻，等.金屬螯合肽分離純化及其抗氧化活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2016，22(3)：35-39.