黃 琰，王燕平，張維波，賈術(shù)永，李宏彥，王 澤，葉豐瑤，王廣軍，田宇瑛

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

中醫(yī)基礎(chǔ)研究常需建立各種動(dòng)物模型，其中證候模型是一個(gè)重要方面。陳小野曾對(duì)脾虛證、腎虛證等模型進(jìn)行過系統(tǒng)研究[1-2]，并總結(jié)撰著了《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》[3]?！鹅`樞·經(jīng)別》指出：“夫十二經(jīng)脈者，人之所以生，病之所以成，人之所以治，病之所以起”，認(rèn)為經(jīng)脈是疾病形成及治療的關(guān)鍵。經(jīng)脈病候是中醫(yī)最早總結(jié)出來(lái)的證候模型之一，但相關(guān)的動(dòng)物模型研究較少。《靈樞·刺節(jié)真邪》指出：“一經(jīng)上實(shí)下虛而不通者，此必有橫絡(luò)盛加于大經(jīng)，令之不通。”經(jīng)脈不通是中醫(yī)病機(jī)理論中重要的發(fā)病機(jī)制，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理學(xué)層面。研究經(jīng)脈的病理作用常采用阻斷經(jīng)脈的方法，即制造“經(jīng)脈不通”的病理模型。1997年張維波提出了經(jīng)絡(luò)的低流阻組織液通道學(xué)說，并發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)低流阻通道[4]，隨后又對(duì)凝膠堵塞建立的經(jīng)脈不通病理模型進(jìn)行了一系列研究[5-7]?，F(xiàn)在常用的經(jīng)脈阻斷方法有注射胰酶[8]、機(jī)械壓迫[9]、切斷經(jīng)脈沿線脂肪帶[10]以及注射水凝膠[5]等。注射胰酶、機(jī)械壓迫均未見形成穩(wěn)定的經(jīng)脈不通模型，且阻斷時(shí)間有限；切斷經(jīng)脈沿線脂肪帶可阻斷針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但對(duì)其阻斷效應(yīng)的延續(xù)時(shí)間尚未作進(jìn)一步研究，且皮下脂肪可能隨時(shí)間推移囤積而影響阻斷效果；凝膠注射效果較好，可形成較穩(wěn)定的經(jīng)脈不通模型，但凝膠注射到體內(nèi)后，如果時(shí)間較長(zhǎng)，仍會(huì)有部分發(fā)生吸收和擴(kuò)散，特別是下肢部活動(dòng)較多的地方。因此，建立一種更穩(wěn)定的經(jīng)脈不通病理模型在經(jīng)絡(luò)研究中尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。醫(yī)用縫合針(規(guī)格01/2 5×12)、醫(yī)用絲線(S26，No.4)，異氟烷(河北一品制藥有限公司生產(chǎn))用于動(dòng)物麻醉。5726F30 經(jīng)絡(luò)測(cè)定儀(東華電子儀器廠)、生物流阻/組織液壓測(cè)量?jī)x(自行研制)、配套小動(dòng)物麻醉機(jī)(Matrx VMR，美國(guó)MIDMARK集團(tuán))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及前期準(zhǔn)備 按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為結(jié)扎1組、結(jié)扎2組、結(jié)扎3組、結(jié)扎4組各12只共48只。用脫毛劑進(jìn)行脫毛處理，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食2 h。將大鼠放入麻醉機(jī)誘導(dǎo)盒內(nèi)通入濃度為2%的異氟烷混合氧(異氟烷與氧氣的混合氣體)誘導(dǎo)吸入麻醉后，取出并使用面罩持續(xù)以濃度為1%～2%的異氟烷混合氧吸入維持麻醉。

1.2.2 任脈低電阻線的測(cè)量 大鼠麻醉后固定，使用5726F30經(jīng)絡(luò)測(cè)定儀，銅板電極連接大鼠尾部任意一處，銅筆電極在腹部任脈區(qū)域(腹部正中線區(qū)域)的皮膚表面進(jìn)行緩慢、輕柔的測(cè)量(方向與任脈垂直)；當(dāng)儀表盤顯示有較大電流通過時(shí)，用紅色記號(hào)筆標(biāo)記為低電阻點(diǎn)，測(cè)5～10個(gè)低電阻點(diǎn)，間距0.5～1 cm，所測(cè)低電阻點(diǎn)連成的平滑曲線即任脈的低電阻線，代表任脈的定位，簡(jiǎn)稱任脈線。

1.2.3 組織液壓波的測(cè)量 圖1顯示，在腹部任脈線上選取長(zhǎng)4～5 cm的一段作為測(cè)量區(qū)，分別將近心端和遠(yuǎn)心端標(biāo)記為A點(diǎn)和B點(diǎn)。用測(cè)量組織液波壓傳播法[11]測(cè)量任脈線的組織液壓波傳播。具體操作如下：使用生物流阻/組織液壓測(cè)量?jī)x，將由帶側(cè)孔6號(hào)注射器針頭制作的測(cè)試針頭向心方向由B點(diǎn)插入大鼠任脈皮下，使側(cè)孔位于距B點(diǎn)1 cm處的任脈線皮下，用安固特膠將針頭固定于皮膚，該針頭用于測(cè)量組織液壓波的傳播；用2 ml注射器由與任脈垂直方向從A點(diǎn)旁開1 cm處插入皮下至A點(diǎn)，在A點(diǎn)注入生理鹽水形成人工丘泡。從注射器迅速注入0.1 ml的生理鹽水到任脈組織中，形成一個(gè)小丘泡，然后立刻在丘泡上施加一個(gè)50 g的砝碼，砝碼放在20 ml的注射針管內(nèi)保持與皮膚垂直，施加后在丘泡部位形成壓力波，同時(shí)測(cè)量任脈線上B點(diǎn)的組織液壓變化，采集5.5 s的壓力數(shù)據(jù)；測(cè)試針頭連接傳感器的組織液壓信號(hào)經(jīng)儀器放大后，由計(jì)算機(jī)的A/D電路采集，采集速率0.1375 s，采集后做成文件儲(chǔ)存。將施加砝碼前后的組織液壓平均值的差值作為組織液壓波的傳播幅度[5, 11]。

圖1 大鼠經(jīng)脈結(jié)扎對(duì)組織液壓波傳導(dǎo)影響實(shí)驗(yàn)示意圖注：EV.電磁閥；P.壓力傳感器；N1.測(cè)試針；N2.注射針；B點(diǎn).測(cè)試針頭插入點(diǎn)；A點(diǎn).皮丘注射點(diǎn)；a.經(jīng)上結(jié)扎處；b.經(jīng)外結(jié)扎處

1.2.4 經(jīng)脈結(jié)扎方法 圖2顯示，結(jié)扎1組在A、B點(diǎn)之間選1個(gè)點(diǎn)，以任脈線為中心，左/右各取5 mm/5 mm作為結(jié)扎進(jìn)針點(diǎn)和出針點(diǎn)；結(jié)扎2組在A、B點(diǎn)之間選2個(gè)點(diǎn)，兩點(diǎn)之間間隔1～2 mm，以任脈線為中心，左/右分別取4 mm/6 mm和6 mm/4 mm作為結(jié)扎進(jìn)針點(diǎn)和出針點(diǎn)；結(jié)扎3組在A、B點(diǎn)之間選3個(gè)點(diǎn)，三點(diǎn)之間分別間隔1～2 mm，以任脈線為中心，左/右分別取4 mm/6 mm、5 mm/5 mm和6 mm/4 mm作為結(jié)扎進(jìn)針點(diǎn)和出針點(diǎn)；結(jié)扎4組在A、B點(diǎn)之間、任脈線旁開1 cm、2 cm處各選1個(gè)點(diǎn)作為結(jié)扎進(jìn)針點(diǎn)和出針點(diǎn)。各組進(jìn)針點(diǎn)和出針點(diǎn)的連線均與任脈線方向垂直。為避免結(jié)扎時(shí)進(jìn)出針拉扯對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾，各組均在測(cè)量前先將結(jié)扎線按各組進(jìn)出針點(diǎn)穿好再進(jìn)行任脈線的組織液壓波傳播幅度的測(cè)量，然后再采用各組結(jié)扎方法。具體方法如下：用縫合針(規(guī)格01/2 5×12)穿過進(jìn)針點(diǎn)皮膚，穿過其皮下肌肉，從出針點(diǎn)穿出，用4號(hào)絲線將所選部位皮膚與其皮下肌肉緊密結(jié)扎在一起，結(jié)扎寬度為1 cm。

圖2 大鼠結(jié)扎后的即刻解剖觀察注：箭頭為結(jié)扎處絲線

1.2.5 結(jié)扎后組織液壓波的測(cè)量與指標(biāo)計(jì)算方法 各組結(jié)扎完成后，再次用同樣的方法測(cè)得結(jié)扎后任脈線的組織液壓力傳播幅度。分別計(jì)算結(jié)扎前施加壓力后和施加壓力前的液壓差的絕對(duì)值、結(jié)扎后施加壓力后和施加壓力前的液壓差的絕對(duì)值，取兩者平均值得出各組在結(jié)扎前后的壓力幅度并計(jì)算變化率，變化率計(jì)算公式為：變化率=(結(jié)扎后壓力幅度-結(jié)扎前壓力幅度)/結(jié)扎前壓力幅度。

2 結(jié)果

2.1 組織液壓波傳播的變化

表1圖3顯示，4組大鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

表1 結(jié)扎對(duì)任脈線壓力波傳播幅度的影響

注：與結(jié)扎前比較:**P<0.01

圖3 結(jié)扎前后任脈組織液壓波傳播幅度變化率

圖4顯示，在經(jīng)脈外結(jié)扎，其組織液壓波傳導(dǎo)幅度有所增加，在任脈線上結(jié)扎其傳導(dǎo)幅度下降，并隨著結(jié)扎點(diǎn)的增多下降幅度增大，結(jié)扎3個(gè)點(diǎn)的下降幅度與結(jié)扎前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 任脈線外與線上結(jié)扎的組織液壓波變化注：(1)任脈外結(jié)扎前后壓力變化；(2)任脈線上結(jié)扎3個(gè)點(diǎn)前后的壓力變化；a.結(jié)扎前施加砝碼前的壓力；b.結(jié)扎前施加砝碼后的壓力；c.結(jié)扎后施加砝碼前的壓力；d.結(jié)扎后施加砝碼后的壓力

2.2 結(jié)扎8周后的組織結(jié)構(gòu)變化

圖5顯示，對(duì)20只大鼠進(jìn)行結(jié)扎后的長(zhǎng)期飼養(yǎng)，于8周后解剖觀察發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎部位皮膚與肌肉緊密黏連。

圖5 大鼠任脈結(jié)扎后8周的解剖觀察注：a.皮膚與皮下肌肉之間出現(xiàn)明顯黏連，箭頭為縫合線頭大鼠啃噬機(jī)化后的遺留物；b.將結(jié)扎處皮膚拉起后皮下肌肉被同時(shí)牽拉形成的條索物(箭頭所示)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用組織液壓波傳播法測(cè)量結(jié)扎阻斷經(jīng)脈的效果。由于組織液壓波有一定的繞行能力，用一定寬度的結(jié)扎難以完全阻斷其傳導(dǎo)，而為了特異地阻斷某條經(jīng)脈又不能結(jié)扎得太寬，故采用一定間隔的多部位結(jié)扎方法，該法也曾在坐骨神經(jīng)的結(jié)扎實(shí)驗(yàn)中使用[12]。表1圖3可知，在任脈線旁開的部位結(jié)扎，不能使壓力傳導(dǎo)減弱，反而有所增加，而在任脈線上結(jié)扎可導(dǎo)致壓力傳導(dǎo)下降，說明任脈是一條連續(xù)的、可傳導(dǎo)組織液壓波的組織液通道，在任脈外結(jié)扎對(duì)其傳導(dǎo)影響較小。由于壓力波的擴(kuò)散性，在經(jīng)外阻斷可導(dǎo)致壓力波更多地向經(jīng)脈傳遞，使經(jīng)上的傳導(dǎo)幅度增大，可解釋結(jié)扎4組的正向變化率，可能是由于操作及個(gè)體差異，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差較大而未達(dá)到顯著性變化。

比較在經(jīng)脈上結(jié)扎1點(diǎn)、2點(diǎn)和3點(diǎn)的效果發(fā)現(xiàn)，其壓力波下降的幅度逐漸增加，說明結(jié)扎的數(shù)量對(duì)結(jié)扎效果有明顯影響，結(jié)扎3個(gè)點(diǎn)之后，壓力波出現(xiàn)了極顯著減小(P<0.01)，產(chǎn)生了預(yù)期的阻斷效果，說明以1 cm結(jié)扎寬度、相隔1～2 mm結(jié)扎三處可有效阻斷經(jīng)脈中組織液壓波的傳導(dǎo)，結(jié)扎導(dǎo)致組織間隙結(jié)構(gòu)的改變，使組織液壓波無(wú)法傳播，與血管結(jié)扎時(shí)血管間隙變小、血流減少相類似，且可長(zhǎng)時(shí)間保持該狀態(tài)，為建立經(jīng)脈不通模型提供了重要的建模數(shù)據(jù)。

生物結(jié)構(gòu)的功能研究常使用阻斷方法，觀察阻斷前后某個(gè)組織或器官的生理活動(dòng)變化。經(jīng)脈作為中醫(yī)理論認(rèn)定的一種具有傳輸性質(zhì)的生理學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)其功能的研究也可借鑒該方法。經(jīng)脈不通本來(lái)就是經(jīng)絡(luò)的一個(gè)病理狀態(tài)，如何人工可控的制造這一狀態(tài)是經(jīng)絡(luò)研究的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。本團(tuán)隊(duì)于2009年建立了凝膠注射阻斷經(jīng)脈的方法，并用組織液壓波傳播的方法證明當(dāng)注射的凝膠量大于0.5 ml時(shí)，可有效阻斷經(jīng)脈低流阻通道的傳導(dǎo)[5]，該方法可長(zhǎng)期阻斷經(jīng)脈并產(chǎn)生相應(yīng)的病理表現(xiàn)，如胃經(jīng)、腎經(jīng)不通小型豬在大小便、體尺、牙齒尺寸等宏觀指標(biāo)上表現(xiàn)出變化及差異[7]；胃經(jīng)不通小型豬在胃腸狀態(tài)方面出現(xiàn)不同程度的脹氣[6]，在行為方面出現(xiàn)夜間活動(dòng)及爬欄次數(shù)增多等煩躁不安的表現(xiàn)[13]；小型豬阻斷經(jīng)脈后出現(xiàn)持續(xù)性痛閾改變[14]。但凝膠有一定流動(dòng)性，解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)注射的凝膠在腿部有部分?jǐn)U散，一定程度上減弱了阻斷的效果。

血管結(jié)扎法已在臨床研究與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中廣泛使用，如冠脈結(jié)扎制備心肌梗死模型[15]等，而表淺部位的血管結(jié)扎對(duì)全身影響較小。而循經(jīng)低流阻通道主要位于皮膚與肌肉之間的皮下疏松結(jié)締組織構(gòu)成的間隙，采用一定寬度的線結(jié)扎法使該結(jié)構(gòu)變窄乃至封閉后，不影響其他組織的活動(dòng)，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試采用結(jié)扎法作為阻斷技術(shù)。該方法使用醫(yī)用縫合線，與組織有一定的相容度，且不易被組織吸收也不會(huì)擴(kuò)散，僅導(dǎo)致組織間隙的減小，對(duì)其他組織如神經(jīng)和血管基本無(wú)大影響。8周后的解剖觀察表明，持續(xù)的慢性結(jié)扎進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)扎部位皮膚與肌肉的緊密黏連，加強(qiáng)了經(jīng)脈不通的病理效應(yīng)，與中醫(yī)臨床所見的慢性疼痛病灶點(diǎn)即局限性無(wú)菌性炎癥的組織黏連變化有一定的相似性[16]。

大鼠是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)最常用的動(dòng)物模型，由于其皮下組織疏松、易滑動(dòng)進(jìn)行低流阻通道的測(cè)量有一定難度，在小型豬上使用的凝膠注射法難以移植到大鼠上，使得一些觀察如使用曠場(chǎng)儀的動(dòng)物行為學(xué)研究難以進(jìn)行，但大鼠可測(cè)量循經(jīng)低電阻線。以往研究發(fā)現(xiàn)，小型豬的循經(jīng)低流阻通道與循經(jīng)低電阻線基本重合[4]，又對(duì)組織液壓波沿大鼠任脈低流阻點(diǎn)的傳播特性進(jìn)行了研究[11]，證明其方法學(xué)的可行性。因此本實(shí)驗(yàn)利用循經(jīng)低電阻線代替循經(jīng)低流阻通道的位置，這兩者的平均距離在小型豬上為1.5 mm[4]，小型豬和大鼠同屬于哺乳類動(dòng)物，在大鼠上的距離會(huì)更小，而結(jié)扎的寬度為10 mm，故完全可以阻斷大鼠的低流阻通道。本研究首次使用結(jié)扎法在大鼠上建立經(jīng)脈不通的病理模型，使得未來(lái)的經(jīng)絡(luò)病理學(xué)研究可在最常用的大鼠上進(jìn)行，大大擴(kuò)充經(jīng)絡(luò)病理學(xué)研究的范圍。

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