余 敏，唐成林，馮啟廷，高睿琦，曹 凈

(1. 重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，北碚 400700； 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016)

非酒精性脂肪肝病是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激性肝臟損傷綜合癥，以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性與脂肪貯積為病理學(xué)特征[1]。目前高脂飲食導(dǎo)致的非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率越來越高。最近的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國成年人群中NAFLD患病率接近15% (6.3%～27.0%)[2]。既往對于非酒精性脂肪肝病的研究多集中在脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激等方面。近期研究證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與其發(fā)病密切相關(guān)[3]。ERS時未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR) 可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和肝細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致NAFLD[4]。蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶1(IRE1)是UPR的關(guān)鍵信號分子[5]，且PERK、IRE1信號通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的連接中發(fā)揮著重要作用[6]。

近年來，針刺治療非酒精性脂肪肝病在臨床中取得了較大的進(jìn)展，且實驗證實電針可以改善脂質(zhì)代謝紊亂[7-9]?！柏S隆”穴屬于祛痰要穴，在臨床上是治療肥胖、脂代謝紊亂的經(jīng)驗穴，但電針“豐隆”穴能否改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，以達(dá)到治療非酒精性脂肪肝病的作用機制尚不明確。故本實驗通過高脂飲食誘導(dǎo)NAFDL模型大鼠，觀察電針“豐隆”穴對NAFLD大鼠肝細(xì)胞病理形態(tài)變化和血清FFA、TG及肝臟TNF-α、IL-6、p-PERK、p-IRE1α的影響，探討電針改善NAFLD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)信號通路的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

70只SPF級8周齡雄性SD大鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(實驗動物合格證號SCXK渝2012-0002)，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房，環(huán)境安靜，室溫(22±2) ℃，自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑與儀器

豬油及基礎(chǔ)飼料(重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)，膽固醇、膽酸鈉、丙硫氧嘧啶(北京索萊寶科技有限公司)，蔗糖(成都科龍化工試劑廠)，F(xiàn)FA、TG測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；p-PERK一抗(美國Cell Signaling Technology公司)、p-IRE1α一抗(美國Novus Biologicals公司)，二抗：HRP辣根過氧化物標(biāo)記生物素(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TRNzol總RNA提取試劑及DL2000Marker(北京天根生化科技有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)，GAPDH、TNF-α、IL-6引物(上海生工生物工程有限公司)。

低溫離心機(美國SIGAM公司)，PCR system 7500(美國Applied Biosy Stems公司)，CFX PCR儀(美國Bio-Rad公司)，華佗牌針灸針(0.25 mm×15 mm)及華佗牌SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，Chem GelDocXR凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型的建立及分組 參照文獻(xiàn)[7]建立大鼠非酒精性脂肪肝病模型，70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法選取15只作為普通飲食組，飼以普通基礎(chǔ)飼料；其余55只作為高脂造模組，飼以高脂飼料(膽固醇2%，膽酸鈉0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，豬油10%及普通基礎(chǔ)飼料82.3%)建立NAFLD模型大鼠。5周后普通飲食組、高脂造模組分別隨機抽取2只大鼠脫頸處死，取肝臟組織做HE染色，觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，驗證造模是否成功。HE染色顯示，普食組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，僅存在極少量脂滴；而高脂造模組肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松，可見大量脂滴，呈大泡型脂肪變性，表示造模成功。從余下的普食組中隨機選取12只作為普食組(C)，將高脂造模組中隨機選取12只為高脂對照組(HF)，12只為手針“豐隆”組(AF)，12只為電針“豐隆”組(EAF)，12只為電針“足三里”組(EAZ)。普食組繼續(xù)喂養(yǎng)普通基礎(chǔ)飼料，其余各組繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料。

1.3.2 干預(yù)方法 普食組和高脂對照組大鼠每天只進(jìn)行固定，不給予針刺干預(yù)。手針“豐隆”組和電針“豐隆”組選取兩側(cè)“豐隆”穴進(jìn)行針刺，電針“足三里”組選取兩側(cè)“足三里”穴進(jìn)行針刺。穴位的定位參照李忠仁《實驗針灸學(xué)》[10]，0.25 mm×15 mm毫針勻速進(jìn)針，直刺5 mm。電針“豐隆”組與電針“足三里”組針刺后連接電針儀，電針強度5mA，疏密波(疏波頻率4 Hz，密波頻率20 Hz)[11]，每日1次，每次留針20 min，連續(xù)干預(yù)4周。干預(yù)期間普食組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。實驗動物的處置遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)定，且符合重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 血清FFA、TG測定 干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠禁食過夜，10%水合氯醛麻醉，心臟取血3 ml靜置20 min，離心機分離血清(3000 r/min)保存于4 ℃冰箱，采用酶標(biāo)儀比色法檢測血清FFA，GPO-POD酶法檢測血清TG，具體檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 HE染色法觀察肝臟細(xì)胞病理形態(tài)變化 取肝臟左葉組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水后浸蠟包埋、切片，二甲苯和無水乙醇進(jìn)行切片脫蠟、染色、復(fù)染，脫水后中性樹膠封片。上述實驗操作由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織切片室完成，在重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院光鏡下觀察采集圖像。

1.4.3 肝臟p-PERK、p-IRE1α蛋白和TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá) 麻醉后迅速取肝組織放入液氮，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?) Western-blot法檢測肝臟p-PERK、p-IRE1α蛋白表達(dá)：將100 mg大鼠肝臟組織剪碎，加入0.2 ml RIPA和2μLPMSF，用勻漿器于冰上充分勻漿。在冰上裂解30 min后移入離心管，4 ℃ 20000 g離心30 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品和樣品緩沖液以4∶1的比例混合，沸水浴5 min后上樣。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。將膜置于5%的脫脂牛奶封閉液中，于搖床上封閉1 h，PBST漂洗 3次；加入一抗(稀釋比例p-PERK:1∶1000，p-IRE1α:1∶1000)4 ℃孵育過夜，取出一抗PBST漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗，搖床輕搖1 h，TBST室溫脫色搖床上洗3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)、顯影、定影。凝膠成像儀掃描分析，以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度比值代表p-PERK和p-IRE1α在肝臟組織中的表達(dá)水平。2) RT-PCR法檢測肝臟TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)：取大鼠肝臟組織約50 mg，按TRNzol試劑說明書提取組織總的RNA，用紫外分光光度計檢測RNA的濃度及OD260/OD280的比值。按Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將取2μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為：42 ℃→10 min→30 ℃→20 min～99 ℃→5min→4 ℃→5min。引物設(shè)計與合成：TNF-α上游引物：5’-GCGCCCAGCCTTCCTTACG-3’；下游引物：5’-CCCCCGGCCTTCCAAATAAATAC -3’,PCR產(chǎn)物152 bp；IL-6上游引物：5’-CCCACCAGGAACGAAAGTCAAC-3’；下游引物：5’-CCATTGCACAACTCTTTTCTCATT-3’,PCR產(chǎn)物103 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物:5’-GGGGTGATGCTGGTGCTGAGTATG-3’，下游引物：5’-CCGCCTGCTTCACCACCTTCT、T-3’，PCR產(chǎn)物538 bp。將TNF-α、IL-6及GAPDH引物與逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，96℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取15 μL反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，GelDocXR凝膠成像儀進(jìn)行掃描，Quantity One軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，計算TNF-α和IL-6 mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 觀察各組大鼠的一般情況及肝臟細(xì)胞病理形態(tài)

實驗期間普食組大鼠毛發(fā)整潔有光澤，活動靈活，飲食、水正常，排泄物正常，體質(zhì)量穩(wěn)定增加；高脂組大鼠活動減少，皮毛凌亂，飲食、水正常，排泄物油膩，體質(zhì)量增長比普食組多；各干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均增長緩慢，活動稍增多，皮毛呈淺黃色，排泄物較正常。

圖1顯示，HE染色后光鏡下觀察普食組大鼠肝細(xì)胞排列整齊、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇正常，偶見少量細(xì)胞內(nèi)存在脂滴；高脂對照組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，體積變大，胞漿疏松，細(xì)胞內(nèi)見大量大泡型脂肪空泡，胞核偏移；手針“豐隆”組肝細(xì)胞腫脹，內(nèi)見小泡型脂滴，較高脂對照組減輕；電針“豐隆”組與電針“足三里”組肝細(xì)胞排列有序，細(xì)胞脂肪變性程度較高脂對照組明顯下降，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常。

圖1 HE染色顯示各組大鼠肝臟細(xì)胞病理變化(×40)

2.2 各組大鼠血清FFA、TG含量比較

表1顯示，高脂對照組大鼠血清FFA、TG含量顯著高于普食組(P<0.01)；干預(yù)后手針“豐隆”組、電針“豐隆”組與電針“足三里”組大鼠血清FFA、TG含量較高脂對照組顯著降低(P<0.01)；與手針“豐隆”組比較，電針“豐隆”組血清FFA、TG含量顯著降低(P<0.01)；電針“豐隆”組血清FFA含量低于電針“足三里”組(P<0.05)，而血清TG含量在電針“豐隆”組與電針“足三里”組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠肝臟組織中p-PERK和p-IRE1α蛋白表達(dá)比較

圖2表1顯示，高脂對照組大鼠肝臟p-PERK和p-IRE1α蛋白表達(dá)顯著高于普食組(P<0.01)；手針“豐隆”組、電針“豐隆”組與電針“足三里”組大鼠肝臟p-PERK和p-IRE1α蛋白表達(dá)顯著低于高脂對照組(P<0.01)；電針“豐隆”組大鼠肝臟p-PERK和p-IRE1α蛋白表達(dá)低于手針“豐隆”組(P<0.05)；電針“豐隆”組大鼠肝臟p-PERK低于電針“足三里”組(P<0.05)，而p-IRE1α蛋白在電針“豐隆”組與電針“足三里”組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 大鼠各檢測指標(biāo)表達(dá)情況

注:與普食組比較:##P<0.01；與高脂對照組比較:**P<0.01；與手針“豐隆”組比較:△P<0.05,△△P<0.01；與電針“豐隆”組比較:☆P<0.05

圖2 各組大鼠肝臟p-PERK和p-IRE1α蛋白表達(dá)比較注:C.普食組；HF.高脂對照組；AF.手針“豐隆”組；EAF.電針“豐隆”組；EAZ.電針“足三里”組

2.4 各組大鼠肝臟TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)比較

圖3和表1顯示，高脂對照組大鼠肝臟 TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)顯著高于普食組(P<0.01)；手針“豐隆”組、電針“豐隆”組與電針“足三里”組大鼠肝臟TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)顯著低于高脂對照組(P<0.01)；電針“豐隆”組大鼠肝臟TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)顯著低于手針“豐隆”組(P<0.01)，且電針“豐隆”組表達(dá)低于電針“足三里”組(P<0.05)

圖3 各組大鼠肝臟TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)比較注:C.普食組；HF.高脂對照組；AF.手針“豐隆”組；EAF.電針“豐隆”組；EAZ.電針“足三里”組

3 討論

NAFLD患者往往伴有肥胖或代謝紊亂，又被視為代謝綜合征及糖尿病的肝臟表型，肥胖和糖脂代謝紊亂會直接導(dǎo)致代謝性炎癥，炎癥又可以促進(jìn)脂質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的過度沉積，并導(dǎo)致肝臟的脂變性及損傷[12]。在NAFLD發(fā)病過程中，脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)可能引起或是加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)一些紊亂的狀態(tài)，如Ca2+平衡紊亂和錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集,這種紊亂狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[13]。ERS的表現(xiàn)包括未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡和整合應(yīng)激反應(yīng)3個相互交聯(lián)的動態(tài)過程，主要是UPR[14]。UPR是機體對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)性機制[15]，它激活3條典型的信號通路，即蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶1(IRE1)和激活作用轉(zhuǎn)錄因子 (ATF6),在生理狀態(tài)下PERK、IRE1、ATF6以無活性的狀態(tài)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶重鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，發(fā)生ERS時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定失衡，重鏈結(jié)合蛋白與3種感應(yīng)蛋白分離，游離的PERK、IRE-1分別通過各自細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的二聚化和自身磷酸化而受到激活[16]。因此，PERK及IRE1通過跨膜磷酸化而傳導(dǎo)ER應(yīng)激反應(yīng)信號是ERS存在的核心指示物。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時PERK和IRE1α磷酸化水平顯著升高，與肝臟脂質(zhì)沉積有關(guān)[17-18]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時UPR 通路中PERK和IRE1均能導(dǎo)致 NF-κB-Iκ-B 的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)相關(guān)分子的表達(dá)[19]。其中NF-κB是炎性反應(yīng)的中心轉(zhuǎn)錄因子之一，參與多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。如它可調(diào)控TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8等炎癥反應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄；另一方面，炎性細(xì)胞因子可以引起微環(huán)境的改變，從而影響蛋白折疊調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。由此可見，在肝臟脂代謝紊亂中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)，且其關(guān)聯(lián)也不是單方面的。炎癥因子的激活也能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損害，由此使機體處于惡性循環(huán)之中，致肝臟遭受多重打擊導(dǎo)致非酒精性脂肪肝病的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)認(rèn)為，NAFLD主要病機為肝脾氣化失司、痰濁內(nèi)蘊、濕邪內(nèi)生，致肝脾腎功能失調(diào)，終致氣滯、血瘀、痰濕相互搏結(jié)，痹阻于肝臟脈絡(luò)而成。非酒精性脂肪肝病中膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高，可以看作是痰瘀的物質(zhì)基礎(chǔ)和外在表現(xiàn)[21]。“豐隆”穴出自《靈樞·根結(jié)》[22]：“足陽明根于厲兌,溜于沖陽, 注于下陵, 入于人迎, 豐隆也”，類屬足陽明胃經(jīng)絡(luò)穴, 聯(lián)絡(luò)胃脾二經(jīng), 因此針刺該穴具有“一絡(luò)通二經(jīng)”之效，能疏通表里兩經(jīng)之氣血、和胃健脾、化痰利濕，為祛痰要穴。既往研究表明，電針“豐隆”穴對高脂血癥有治療作用[23]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，電針“豐隆”穴能夠明顯下調(diào)高脂血癥大鼠血脂水平，降低肝臟組織中炎癥因子TNF-α蛋白水平[24]，還可調(diào)節(jié)肝脾腎功能，防止肝細(xì)胞脂肪過度沉積、變性，改善和治療非酒精性脂肪性肝炎[25]。

本研究選取“豐隆”穴，采用手針及電針組作對比，再選取“足三里穴”給予電針與電針“豐隆”作對比，采用高脂飼料復(fù)制NAFLD模型大鼠，結(jié)果顯示高脂對照組大鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性，血清FFA、TG及肝臟p-PERK、p-IRE1α、TNF-α及IL-6表達(dá)顯著高于普食組，表明高脂對照組大鼠肝臟脂代謝紊亂，處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥損傷狀態(tài)；單純針刺與電針干預(yù)后肝臟細(xì)胞脂肪變性減輕，且各組血清FFA、TG及肝臟p-PERK、p-IRE1α、TNF-α及IL-6表達(dá)較高脂對照組顯著下調(diào)，提示單純針刺及電針對脂代謝紊亂、肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥損傷狀態(tài)均有良性調(diào)節(jié)作用，能改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與肝臟脂肪沉積變性。其中研究發(fā)現(xiàn)，2電針組干預(yù)效果優(yōu)于單純針刺組，且電針“豐隆”組效果較電針“足三里”組更優(yōu)，表明電針“豐隆”穴對NAFLD的改善效果更為顯著，但2電針組TG、p-IRE1α比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能 “豐隆”穴、“足三里”均位于足陽明胃經(jīng)，有部分主治功效相同，是否具有相同作用機制尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究闡明其具體機理。

綜上所述，實驗表明電針可以下調(diào)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號分子p-PERK、p-IRE1α的表達(dá)，改善NAFLD 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步抑制下游炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)的釋放，此外還可調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，減少肝臟脂質(zhì)沉積變性，且電針“豐隆”穴效果尤為顯著。由此可推測，電針改善NAFLD的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)信號通路、改善ERS、減輕炎癥損傷狀態(tài)、改善脂質(zhì)代謝、減輕肝臟脂肪變性而實現(xiàn)的。這可能為臨床選擇電針“豐隆”穴治療非酒精性脂肪肝病提供理論依據(jù)。

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