呂 坤 洪瓊川 鄧友君

(深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518116)

早期肺癌是是最常見的惡性腫瘤之一，循環(huán)腫瘤細胞由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入外周血，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，ctDNA是脫氧核糖核酸，在惡性腫瘤患者定向遷移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，具有增殖與免疫的功能，可調(diào)控單核細胞、T細胞、巨嗜細胞系的遷移[1]。最近的研究顯示，ctDNA與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及單核細胞浸潤有關(guān)，在腫瘤診斷、監(jiān)測復(fù)發(fā)、治療療效預(yù)后評估中應(yīng)用廣泛[2]。但關(guān)于ctDNA在早期肺癌的研究卻罕見報道，鑒于此，本研究就ctDNA和微淋巴管密度在早期肺癌中表達進行研究，探討ctDNA的表達水平與微淋巴管密度的相關(guān)性，分析與早期肺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集在2012年5月至2015年12月我院普外科經(jīng)早期肺癌根治術(shù)切除，證實為早期肺癌組織標本94例，病理學(xué)檢查組織標本保存于我院中心實驗室-80 ℃冰箱。男37例，女57例，平均年齡為(63.2±12.1)歲，II～IV期38例，I～II期56例，腫瘤大小≤5 cm 34例，腫瘤大小>5 cm 60例；20例早期肺癌伴肝轉(zhuǎn)移，46例早期肺癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。中低分化59例，高分化35例。入選標準：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查診斷為早期肺癌，接受早期肺癌根治術(shù)；②距離腫瘤邊緣>5 cm，手術(shù)前未接受放化療和生物治療。正常的癌旁組織為對照組50例，經(jīng)病理學(xué)檢查確定。

1.2 研究方法

1.2.1實時定量PCR檢測ctDNA mRNA的表達水平 ctDNA mRNA的表達水平采用實時定量PCR檢測。具體過程如下：早期肺癌及癌旁組織采用RNA Extraction QIA quick Kit(QIAGEN公司，德國)進行總RNA抽提。設(shè)計ctDNA熒光定量引物。合成cDNA第一鏈，根據(jù)ctDNA基因序列，操作說明(Takara公司，日本)。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：1 μlcDNA第一鏈，10 μl 2x Trans Start Top Green qPCRSuperMix，10 μM引物2為 0.6 μl，10 μM引物1為0.6 μl，ddH2O 7.4 μl，Reference Dye Passive 0.4 μl(北京全式金有限公司)，35個循環(huán)。ctDNA及GAPDH基因的Ct值應(yīng)用ABI7500分析軟件分析，采用2- Ct法計算正常癌旁組織、早期肺癌組織的ctDNA表達量。

1.2.2免疫組化染色檢測ctDNA在早期肺癌組織中的表達 按1∶200稀釋ctDNA抗體，免疫組織化學(xué)染色對癌旁組織、早期肺癌組織標本檢測，顯微鏡下選取5個視野，陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，陽性判斷：淡黃色至棕褐色顆粒。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料進行χ2檢驗，計量資料進行t檢驗，采用Pearson分析相關(guān)性，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ctDNA的mRNA 表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

ctDNA的mRNA 表達與早期肺癌分化程度、年齡、性別、組織學(xué)類型均無相關(guān)性(P>0.05)；I～II期患者ctDNA mRNA 表達水平明顯低于III～IV期患者(P<0.05)，早期肺癌患者腫瘤大小>5 cm的ctDNA mRNA 表達水平明顯高于腫瘤大小≤5 cm者，差異具有統(tǒng)計意義(P=0.003)；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移的ctDNA mRNA 表達水平高于無轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計意義(P<0.05)，見表1。

表1 早期肺癌臨床病理特征與ctDNA的mRNA 表達水平關(guān)系

2.2 兩組免疫組化檢測結(jié)果分析

正常癌旁組織中ctDNA陽性表達12例，早期肺癌組織中ctDNA 陽性表達65例，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.036，P=0.002)，見表2。

表2 早期肺癌組織及癌旁組織ctDNA陽性表達比較/例

3 討 論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與許多因素有關(guān)，研究表明[6]，ctDNA是原發(fā)腫瘤細胞脫落進入血管中的腫瘤細胞，其可通過自分泌或旁分泌方式誘導(dǎo)癌細胞的增殖，釋放炎癥細胞因子，控制免疫細胞趨化，刺激新血管形成，還可輔助間質(zhì)細胞進行侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。ctDNA是一項高效可行的方法，具有調(diào)控單核細胞/巨嗜細胞系、T細胞遷移、增殖與免疫的功能，外周血中檢測到ctDNA是癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的指示，可作為腫瘤組織的可靠來源，在靜止期單核細胞、記憶性的T淋巴細胞、樹突狀細胞等細胞膜上有顯著高表達[4]。ctDNA的表達水平、腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、復(fù)發(fā)均具有相關(guān)性。據(jù)報道，在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中、腫瘤組織外周ctDNA高表達，在高內(nèi)皮微靜脈、淋巴結(jié)濾中、內(nèi)皮細胞中也呈高表達[5]。早期肺癌易通過淋巴結(jié)向肝、肺等遠處發(fā)生轉(zhuǎn)移，是消化道常見的惡性腫瘤，關(guān)于早期肺癌中ctDNA表達及臨床意義的研究報道甚少，有研究指出，ctDNA被認為與早期肺癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)具有相關(guān)性。ctDNA是評價惡性腫瘤預(yù)后的重要指標淋，與癌癥的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。鑒于此，本研究就ctDNA在早期肺癌中的作用進行探究。

本研究采用實時熒光定量PCR對早期肺癌中組織和正常癌旁組織ctDNA的mRNA 表達水平進行檢測，結(jié)果顯示，早期肺癌組織ctDNA mRNA水平明顯高于正常癌旁組織的ctDNA mRNA水平，提示ctDNA高表達水平與早期肺癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。進一步對ctDNA的mRNA 表達水平與臨床病理特征的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，ctDNA的mRNA 表達水平與腫瘤大小有關(guān)。目前，有研究指出，ctDNA可能參與了早期肺癌細胞的轉(zhuǎn)移過程，通過淋巴結(jié)選擇性高表達配體與高表達ctDNA的早期肺癌細胞的結(jié)合，通過淋巴系統(tǒng)向遠處發(fā)生轉(zhuǎn)移進一步輔助腫瘤細胞結(jié)合，本研究中，ctDNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中mRNA 表達水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，進一步說明了ctDNA出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移患者ctDNA的mRNA表達水平明顯高于未出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，在早期肺癌細胞轉(zhuǎn)移過程中的作用，高表達的ctDNA水平會促進早期肺癌細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，ctDNA的mRNA 表達肝轉(zhuǎn)移患者水平明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時采用免疫組化的方法檢測ctDNA在早期肺癌組織和正常癌旁組織中表達，結(jié)果顯示ctDNA在早期肺癌組織陽性表達明顯高于正常癌旁組織中的表達，與ctDNA的mRNA 表達水平分析結(jié)果一致。

綜上所述，ctDNA的高表達與轉(zhuǎn)移、早期肺癌發(fā)生顯著關(guān)系，早期肺癌的診斷和預(yù)測轉(zhuǎn)移通過檢測ctDNA可有指導(dǎo)意義。

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