何文彬 李 飛 劉 克 吳超男 劉 佳 李玉琴

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

何首烏(Polygonum multiflorum) 屬多年生纏繞藤本植物，以根入藥。臨床上何首烏有生首烏與制首烏之分：生首烏功能解毒(截瘧)、潤(rùn)腸通便、消癰；制首烏功能補(bǔ)益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎[1]。目前已經(jīng)研究得到何首烏中的主要成分有大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、大黃酸等蒽醌類及芪類成分。蒽醌類化合物具有調(diào)血脂、抗菌、強(qiáng)心、抗癌、心肌損傷保護(hù)、潤(rùn)腸通便的作用[2-4]。目前市面上有多種何首烏，質(zhì)量參差不一，因此很有必要對(duì)不同種何首烏中蒽醌類化合物的含量進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定白首烏、赤首烏以及市售何首烏大黃素、大黃素甲醚的含量，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公公司)、UV200紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(大連依利特分析儀器有限公司)、水浴鍋(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)、FA2004N型電子天平(上海民析精密科學(xué)儀器公司)、TG-16G高速離心機(jī)(鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、粉碎機(jī)(青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司)、KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

大黃素甲醚對(duì)照品(成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)PS0291-0020)、大黃素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110756-200110)色譜純甲醇(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)、分析純磷酸(萊陽市康德化工有限公司)、分析純氯仿、娃哈哈純水。泰山白首烏、赤首烏均采自泰山醫(yī)學(xué)院藥用植物園(經(jīng)劉克老師鑒定)，自然晾干，備用。市售何首烏購自泰安市藥材市場(chǎng)。

1.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取大黃素對(duì)照品適量，用甲醇配制成1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液，備用。1.0 mg/ml大黃素甲醚對(duì)照品溶液配制方法同上。

1.4 供試品溶液制備

取自然晾干的白首烏根樣品粉碎，精密稱取10 g，置于50 ml具塞錐形瓶中，加30 ml氯仿，超聲提取90 min，放冷，抽濾。取續(xù)濾液置于燒杯中，于70 ℃水浴中揮干溶劑，加甲醇定容到10 ml。進(jìn)樣前用微孔濾膜過濾。赤首烏、市售何首烏處理方法同上。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：大連依利特SinochomODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫：室溫；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(90︰10)；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20μl。 在此色譜條件下，對(duì)照品色譜圖見圖1，色譜峰與相鄰峰達(dá)到基線分離。

圖1 對(duì)照品色譜圖(1-大黃素，2-大黃素甲醚)

2.2 線性關(guān)系的考察

取“1.3”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按1.0 μg/ml、2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、25.0 μg/ml濃度梯度配制混合對(duì)照品溶液。精密量取各混合對(duì)照品溶液20μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 大黃素、大黃素甲醚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml低、中、高三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄峰面積，計(jì)算日間和日內(nèi)峰面積的RSD，結(jié)果見表2。由表2可見，RSD均<2.0%，說明方法和儀器精密度良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取“1.4項(xiàng)”下的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定(圖2A、B)，每樣品平均進(jìn)樣3次，記錄峰面積，以3次進(jìn)樣的均值為結(jié)果，計(jì)算白首烏、赤首烏以及市售何首烏的根中大黃素、大黃素甲醚成分的含量。供試品的測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，市售何首烏中大黃素的含量約為泰山赤首烏的2.5倍；大黃素甲醚的含量接近；而白首烏中大黃素和大黃素甲醚均未檢測(cè)到。

圖2 樣品色譜圖(1-大黃素，2-大黃素甲醚)

赤首烏白首烏市售何首烏大黃素(μg/g)35.49未檢出88.03大黃素甲醚(μg/g)35.21未檢出33.43

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收的方法考察方法的準(zhǔn)確度。等體積精密量取已準(zhǔn)確測(cè)定含量的何首烏根部提取液9份，3份一組，每組分別加入高、中、低濃度的混合對(duì)照品溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，每份重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。由表4的可知，該試驗(yàn)的回收率較高，表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、可行。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

3.1 提取方法考察

根據(jù)大黃素和大黃素甲醚的溶解性，分別用氯仿和甲醇采用回流的方法提取，并在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以赤首烏的甲醇提取液色譜圖為例，由圖3可見，甲醇提取率低，直接進(jìn)樣測(cè)定基線不穩(wěn)定，可能是由于大黃素和大黃素甲醚在甲醇中溶解度較低造成的。由于氯仿更容易滲入中藥材組織,且大黃素和大黃素甲醚在氯仿中溶解度較高，所以為提高提取的效率，本實(shí)驗(yàn)選擇氯仿回流提取。

圖3 甲醇提取液色譜圖

3.2 流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化

3.2.1流動(dòng)相磷酸的濃度 在HPLC法中，影響柱效、分離度和分析時(shí)間的因素主要是流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)中采用的流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了磷酸濃度分別為0.05%、0.1%、0.15%時(shí)對(duì)柱效、分離度和分析時(shí)間的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著磷酸濃度的升高，出峰時(shí)間縮短，峰型無太大變化，但由于酸性太高可能對(duì)樣品中有效成分有一定的影響，故本實(shí)驗(yàn)采用的磷酸濃度為0.1%。

圖4 不同磷酸濃度的色譜圖

3.2.2流動(dòng)相比例 在HPLC法中，流動(dòng)相比例的變化也會(huì)對(duì)柱效、分離度和分析時(shí)間產(chǎn)生一定的影響。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和0.1%磷酸比例的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著0.1%磷酸比例的降低，出峰時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變寬，柱效降低，但甲醇比例太高時(shí)樣品峰與雜質(zhì)峰得不到很好的分離，因此，選擇用90︰10甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相。

圖5 流動(dòng)相優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用了高效液相色譜法測(cè)定何首烏中游離大黃素和大黃素甲醚的含量，建立了一系列的測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)量準(zhǔn)確。經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同何首烏中蒽醌類成分的含量不同。在泰山赤首烏以及市售何首烏的根中均檢出大黃素和大黃素甲醚，而泰山白首烏中未檢出。該結(jié)果可為合理使用何首烏提供理論指導(dǎo)。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典,2005版一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:122 -123,187.

[2] Lin LF, Boran N, Lin HM, et al. Simultaneous determination and pharmacokinetic study of P-hydroxybenzaldehyde,2,3,5,40-tetrahydroxystilbene-2-O-β-glucoside, emodin-8-O-β-D-glucop-Yranoside, and emodin in rat plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry after oral administration of Polygonum multiflorum[J]. Anal Meth,2015,7:244-252.

[3] Zhu ZW, Li J, Gao XM, et al. Simultaneous determination of stibenes, phenolic acid, flavonoids and anthraquinones in radix polygoni multiflori by LC-MS/MS[J].Pharma Biom Anal,2012,62:162-166.

[4] He DX, Chen B, Tian QQ, et al. Simultaneous determination of five anthraquinones in medicinal plants and pharmaceutical preparations by HPLC with fluorescence detection[J].Pharm Biom Anal,2009,49:1123-1127.