王海麗 徐園園 宮孟琦 李健 張躍 程立君 劉長樂 劉彤 李廣平 富華穎

糖尿病是心房顫動(dòng)(簡稱房顫)發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。糖尿病和房顫的發(fā)生密切相關(guān)。蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶ABC 家族的一部分，PKCβ屬于經(jīng)典PKC，依賴磷脂酰絲氨酸、Ca2+和甘油二酯或波脂激活。存在重復(fù)富含半胱氨酸C1結(jié)構(gòu)域，氧化應(yīng)激因素可以引起半胱氨酸殘基的C1結(jié)構(gòu)域氧化形成二硫鍵，被認(rèn)為是過氧化或活性氧與PKC 激活的聯(lián)系通路。

我們前期研究結(jié)果表明糖尿病心房肌中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65表達(dá)上調(diào)，其下游產(chǎn)物腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)蛋白表達(dá)增多，導(dǎo)致心房重構(gòu)。NF-κB活化和表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致心房重構(gòu)發(fā)生的重要因素，但是引起心房NF-κB激活的上游機(jī)制尚未明確。

對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的研究表明，PKCβ能夠引起NF-κB的激活以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和TNF-α產(chǎn)生[2]；在炎癥細(xì)胞和心室肌細(xì)胞中PKCβ的激活可引起I-κB磷酸化，導(dǎo)致NF-κB活化[3]；高血糖引起的NF-κB的激活和細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生均可通過PKCβ的抑制劑逆轉(zhuǎn)[4]。越來越多的證據(jù)表明PKCβ亞型在糖尿病并發(fā)癥中異常表達(dá)和激活[5]，在嚙齒動(dòng)物糖尿病心室肌細(xì)胞中PKCβ優(yōu)先過表達(dá)或被激活，抑制PKCβ的活性能夠改善糖尿病大鼠的心室功能[6-7]。糖尿病狀態(tài)下心房肌的PKCβ是否被激活，其激活是否是NF-κB活化的上游機(jī)制還需要進(jìn)一步研究明確。筆者采用PKCβ抑制劑RBX (Ruboxistaurinn,LY333531)干預(yù)，旨在探討PKCβ通路在糖尿病大鼠心房重構(gòu)中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

健康成年wistar雄性大鼠64只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，體重150～200g，進(jìn)行兩部分實(shí)驗(yàn)：第一部分為心臟超聲測定后進(jìn)行組織病理實(shí)驗(yàn)，第二部分為電生理實(shí)驗(yàn)，每部分32只大鼠。隨機(jī)分為四組：對照組(control, C 組) ，糖尿病組(diabetes mellitus, DM 組)，糖尿病+PKCβ抑制劑組(diabetes mellitus + RBX, DMR 組)和正常+ PKCβ抑制劑組(control + RBX, CR組)，每組8只。DM組及DMR組大鼠以65 mg/kg[8]鏈脲菌素溶液腹腔一次性注射給藥，C組及CR組以等容量的檸檬酸緩沖液腹腔一次性注射給藥。CR 組及DMR組大鼠于造模成功后即予以RBX 1 mg·kg-1·d-1[9]灌胃8周，同時(shí)C組及DM組正常飲食8周。

1.2糖尿病模型的建立

鏈脲菌素(天津百倍生物)120 mg加入0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液18 mL中，冰浴下充分溶解，過濾消毒，調(diào)節(jié)酸堿度使pH值為4.2。DM組及DMR組大鼠以65 mg/kg鏈脲菌素溶液腹腔一次性注射給藥。72 h及1周時(shí)分別于清晨空腹(過夜禁食至少8 h，斷尾取血)測量血糖，兩次空腹血糖≥11 mmol/L或單次空腹血糖≥20 mmol/L表示造模成功。檢測建模成功后第1、2、8周血糖及干預(yù)前、干預(yù)8周后體重并計(jì)算兩者體重差值。

1.3心臟超聲測定

CR組及DMR組大鼠于RBX灌胃前及灌胃8周后、C組及DM組同步進(jìn)行心臟超聲檢查。將大鼠放入便攜式多功能麻醉劑誘導(dǎo)箱中, 用異氟烷(吸入體積分?jǐn)?shù)為2 %～3 %異氟烷和97 %～98 %的氧氣)吸入麻醉后取出，并繼續(xù)用異氟烷吸入維持麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，剪去前胸部及四肢體毛，連接體表心電圖。應(yīng)用超聲儀(Visual Sonics Vevo2100成像系統(tǒng))，留取左室長軸觀進(jìn)行分析。于左室長軸觀測量左房前后徑(LAD)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)，測量3次取均值。干預(yù)8周后的兩組大鼠于M型超聲測量左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，測量3次取均值。計(jì)算各組干預(yù)前與干預(yù)8周后LAD差值、LVEDD差值、LVESD差值。

1.4組織病理檢查

1.4.1標(biāo)本選取及處理 干預(yù)8周后且完成心臟超聲測定后的各組大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/Kg麻醉。開胸，從主動(dòng)脈根部離斷心臟，放置于4℃PBS液中洗凈殘血，在冰臺上取左房組織并固定于10%中性福爾馬林液10～14 d。后進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟等實(shí)驗(yàn)步驟制作組織蠟塊并切片。每個(gè)標(biāo)本取10張切片，每張切片厚3～4 μm[10]。

1.4.2HE染色 將制作好的組織切片經(jīng)過脫蠟、脫水處理后用蘇木精染液，伊紅染液進(jìn)行HE染色[10]。取HE染色切片，在400倍視野下選取包括多個(gè)細(xì)胞核位于中心且較圓的心肌細(xì)胞的橫截面視野，每張切片選取10個(gè)細(xì)胞，測量心肌細(xì)胞橫截面積，取均值。

1.4.3Masson染色 將制作好的組織切片經(jīng)過脫蠟、脫水處理后用Weigiet鐵蘇木素、麗春紅酸性品紅、磷鉬酸溶液、1%冰醋酸進(jìn)行Masson染色[10]。取Masson染色切片，在400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，圖像以Tiff 格式存入電腦并應(yīng)用Image Pro Plus 7.0軟件計(jì)算膠原總面積及圖像總面積。膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction, CVF)=膠原總面積/圖像總面積。

1.5電生理檢查

用于電生理檢查的各組大鼠于干預(yù)8周后開胸，于主動(dòng)脈根部以上1 cm水平橫斷主動(dòng)脈，取下心臟置于4℃臺氏液中，沖洗并擠出心腔內(nèi)殘血后迅速將主動(dòng)脈根部套扎于Langendorff灌流管上，灌流系統(tǒng)中溫度為(37±0.5)℃的臺氏液以100 cm H2O壓力逆向灌流。將三對自制雙極電極分別固定于右房( right atrium, RA)、左房(left atrium, LA)、右室(right ventricle, RV)，極間距離2 mm(圖1)，將上述電極連接多道電生理記錄儀(TOP-2001多道電生理系統(tǒng)，上海宏桐實(shí)業(yè)有限公司)，同時(shí)記錄出清晰的各部位雙極電圖?；A(chǔ)起搏周長(pace cycle length, PCL)設(shè)為150 ms。以周長150 ms起搏RA測定心房間傳導(dǎo)時(shí)間(interatrial conduction time, IACT)。以周長150 ms開始，以5 ms遞減測定房室傳導(dǎo)文氏周長(Wenckbach cycle length of AV conduction, AVWCL)。以周長150 ms應(yīng)用S1S2刺激法測定左房、右房有效不應(yīng)期(atrial effective refractory period, AERP)，并計(jì)算AERP的離散度(AERPD)。應(yīng)用Burst刺激(起搏周長分別為50、40、30、25 ms)誘發(fā)房顫，每個(gè)起搏周長刺激5次，共刺激20次，每次間隔30 s。房顫定義為在Burst刺激后心房電圖跟隨著出現(xiàn)快速而不規(guī)則心房激動(dòng)，同時(shí)心室呈不規(guī)則反應(yīng)并持續(xù)超過1 s。

將三對自制雙極電極分別固定于右房、左房、右室，極間距離2 mm

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1四組一般狀況、心臟超聲指標(biāo)比較

與C組相比，DM組及DMR組血糖均顯著升高，體重均顯著降低(P均<0.05)；C組及CR組血糖、體重?zé)o差異(P均>0.05)(表1)。與C組相比，DM組干預(yù)8周后LAD及LAD差值顯著增大，DMR組較DM組干預(yù)8周后LAD及LAD差值減小(P均<0.05)；C組、CR組干預(yù)8周后LAD及LAD差值未見差異(P均>0.05)；四組干預(yù)前LAD、LVEDD、LVESD，干預(yù)8周后LVEDD、LVESD、LVEF，LVEDD差值、LVESD差值均無差異(P均>0.05)(表2)。

表1 四組血糖及體重比較

注：與C組比較,*p<0.05；與DM組比較,#P<0.05

表2 四組超聲心動(dòng)圖參數(shù)

注：LAD=左房前后徑；LVEDD=左室舒張末內(nèi)徑；LVESD=左室收縮末內(nèi)徑; LVEF=左室射血分?jǐn)?shù)。 與C組比較,*P<0.05；與DM組比較,#P<0.05

2.2四組組織病理指標(biāo)比較

與C組相比，DM組大鼠左房肌細(xì)胞排列紊亂；與DM組相比，DMR組大鼠左房肌細(xì)胞排列整齊。與C組相比，DM組大鼠左房肌細(xì)胞橫截面積增大[(86.67±21.95)μm2vs (42.75±18.36)μm2,P<0.05]；與DM組相比，DMR組大鼠左房肌細(xì)胞橫截面積減小[(48.36±16.85)μm2vs (86.67±21.95)μm2,P<0.05]。與C組相比，DM組大鼠左房肌膠原容積分?jǐn)?shù)增大(5.64%±0.96% vs 3.00%±0.93%,P<0.05)；與DM組相比，DMR組大鼠左房肌膠原容積分?jǐn)?shù)減小(3.14%±0.80% vs 5.64%±0.96%,P<0.05)；CR組及C組大鼠，左房肌細(xì)胞排列均整齊無差異，左房肌細(xì)胞橫截面積大小無差異 (CR組：45.94±14.52μm2)，左房肌膠原容積分?jǐn)?shù)大小無差異 (CR組：2.23%±0.40%)(圖2，圖3)。

A：C組，B：DM組，C：CR組，D：DMR組

2.3四組電生理體征比較

與C組相比，DM組大鼠IACT延長, LAERP減小，RAERP減小，AERPD增大(P均<0.05)；房顫誘發(fā)率升高(95/160 vs 10/160,P<0.05)。與DM組相比，DMR組大鼠IACT縮短，LAERP增大，RAERP增大，AERPD減小，P均<0.05；房顫誘發(fā)率明顯減低(14/160 vs 95/160,P<0.05)。C組及CR組IACT, LAERP，RAERP，AERPD無差異(P均>0.05);C組及CR組房顫誘發(fā)率無差異 (CR組：12/160)(圖4，表3)。

A：C組，B：DM組，C：CR組，D：DMR組

A：刺激前各部位雙極電圖，B：Burst刺激后雙極電圖

3 討論

糖尿病是房顫發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而糖尿病引起房顫發(fā)生的機(jī)制目前尚不明確。糖尿病引起房顫的主要病理生理機(jī)制為結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu)。本研究結(jié)果表明PKCβ抑制劑RBX可以明顯減輕糖尿病導(dǎo)致的心房肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)纖維化，并有效抑制糖尿病引起的AERP縮短、AERPD增大及IACT延遲等電重構(gòu)，減少糖尿病大鼠房顫的誘發(fā)率。

表3 四組心率及PCL 150 ms時(shí)電生理參數(shù)比較

注：HR=心率；IACT=房間傳導(dǎo)時(shí)間；AVWCL=房室傳導(dǎo)的文氏周長；RAERP=右房有效不應(yīng)期；LAERP=左房有效不應(yīng)期； AERPD=心房有效不應(yīng)期離散度。與C組比較,*P<0.05；與DM組比較,#P<0.05

越來越多的證據(jù)表明PKCβ亞型在糖尿病并發(fā)癥中異常表達(dá)和激活[5]。在嚙齒動(dòng)物糖尿病心室肌細(xì)胞中PKCβ優(yōu)先過表達(dá)或被激活，抑制PKCβ的活性能夠改善糖尿病大鼠的心室功能[6-7]。鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎功能障礙的研究顯示活性氧可激活PKC，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-kB，也可以上調(diào)TGF-β1，且腎小球系膜細(xì)胞通過晚期糖基化終末期產(chǎn)物蛋白的暴露也可激活PKCβ并增加TGF-β1的表達(dá)[11]。另外，用高糖孵化培養(yǎng)的心肌細(xì)胞是通過DAG-PKC信號通路促進(jìn)NF-κB活化的，此過程增加的PKCα和PKCβ2使MAPK及隨后的I-κB磷酸化[12]。高血糖狀態(tài)下，可以通過PKCβ/NF-κB信號通路，增加TNF-α的mRNA表達(dá)，從而加重糖尿病炎癥狀態(tài)[13]，而NF-κB活化過程的介質(zhì)和產(chǎn)物(如TGF-β1等)能夠引起炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、纖維化、心肌肥厚以及凋亡等，可能是造成糖尿病心房肌細(xì)胞肥大、心房肌纖維化等心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)房顫發(fā)生的原因。本研究結(jié)果顯示應(yīng)用RBX能夠減輕心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，可能是通過抑制PKCβ的激活，減少了其下游炎癥因子如TGF-β1、TNF-α的表達(dá)。

糖尿病引起的心房間質(zhì)纖維化，破壞了細(xì)胞間的偶聯(lián)，阻礙了動(dòng)作電位的傳播，促進(jìn)了心房折返環(huán)的形成。一些研究認(rèn)為異常的心房電位、IACT延遲及AERP的縮短、AERPD增大等電生理特征是心房易損性增加的標(biāo)志，是房顫發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，與房顫的發(fā)生和維持有關(guān)[14]。此外動(dòng)作電位時(shí)程的縮短及傳導(dǎo)速度的減慢增加了房顫發(fā)生的可能。高糖引起的PKC激活可引起離子通道電流的改變，心房電重構(gòu)可表現(xiàn)為心房肌細(xì)胞鈣電流增大，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈉電流減小[15]，細(xì)胞內(nèi)鈣超載可引起Na+/Ca2+交換，生成去極化電流，參與心肌細(xì)胞中鈣波的發(fā)生和傳播，引起延遲后除極，從而導(dǎo)致包括房顫在內(nèi)的心律失常的發(fā)生。本研究結(jié)果表明RBX顯著改善糖尿病導(dǎo)致的IACT延長、LAERP減小、RAERP減小、AERPD增大，減少房顫的發(fā)生。

闡明糖尿病導(dǎo)致房顫的上游機(jī)制是有效預(yù)防糖尿病導(dǎo)致房顫發(fā)生的關(guān)鍵，本研究結(jié)果表明RBX通過改善心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu)，減少房顫的發(fā)生，提示PKCβ激活可能在糖尿病引起房顫中發(fā)揮重要的作用，但研究結(jié)果尚需進(jìn)一步深入的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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