徐雅玲，梁 菁

(廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康評(píng)估教研室，廣西 柳州 545006)

紫杉醇作為廣西特色抗腫瘤中藥，已成為世界公認(rèn)的強(qiáng)活性廣譜抗癌藥物。研究表明，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用[1-3]。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)抗癌藥物在取得療效的同時(shí)，常出現(xiàn)不同程度的毒副作用[4]。而本研究組在前期已經(jīng)證實(shí)紫杉醇具有自身毒副作用，即在一定的質(zhì)量濃度和長(zhǎng)時(shí)間作用下，對(duì)肝細(xì)胞有細(xì)胞毒作用[5]。目前，臨床上已運(yùn)用紫杉醇注射液治療肝癌。然而，這類(lèi)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性差，毒性反應(yīng)較大，易產(chǎn)生耐藥性，這些缺陷對(duì)于臨床的治療帶來(lái)了極大不便[6]。為了探索紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的影響，本研究以肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡檢測(cè)等來(lái)比較分析紫杉醇對(duì)這兩種細(xì)胞的毒性作用。初步探討紫杉醇對(duì)兩種細(xì)胞的凋亡影響，為探索其抗肝癌作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SD大鼠♂，3只, 體質(zhì)量(50±5)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM高糖培養(yǎng)基(DMEM-HG)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)、膠原蛋白酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；紫杉醇購(gòu)自黃石李時(shí)珍藥業(yè)集團(tuán)武漢李時(shí)珍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20058368；Hoechst 33258測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司； Annexin-V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染試劑盒、MTT購(gòu)自碧云天公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3儀器 CKX41SF型倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；水套式CO2恒溫培養(yǎng)箱，Shellab(SL)公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；752N紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MK3 Multiskon型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Labsystems公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡，德國(guó) Leica公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD LSRFortessa公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng) 在37℃電熱恒溫水浴箱中快速解凍肝癌細(xì)胞HepG2，而后將肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基(含100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和200 mol·L-1谷氨酰胺)中，放置在37℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2原代肝細(xì)胞培養(yǎng) 斷頭處死SD大鼠，無(wú)菌分離肝組織后均在冰浴下操作，4℃ PBS充分洗滌肝組織后，剝離肝被膜，機(jī)械剪切成1 mm3左右的組織小塊，加入0.1%的膠原蛋白酶消化5 min，盡可能輕柔的吹散膨松絮狀組織塊，充分洗滌后，加入10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，重懸靜置3 min，棄上段1/3液體，取中下層細(xì)胞懸液種瓶，置于37℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)肝細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3紫杉醇溶液制備 紫杉醇用DMSO助溶(DMSO終體積分?jǐn)?shù)為0.1%)配制為10 mg·L-1的母液，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需終濃度分別為5、10、20、40、80 μg·L-1。

1.2.4MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的毒性 將肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL (1×104細(xì)胞/孔)，用200 μL PBS液填充邊緣孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，將兩類(lèi)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分別分為3組，即空白組、陰性對(duì)照組、紫杉醇組(n=5)?？瞻捉M為含10% FBS的DMEM-HG培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組為含與實(shí)驗(yàn)組等量細(xì)胞的細(xì)胞懸液。紫杉醇組加入終濃度為5、10、20、40、80 μg·L-1的紫杉醇。以上3組分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，放置在搖床上低速震蕩10 min，待紫色結(jié)晶物充分溶解后，置于檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值(optical density，OD)。分別計(jì)算紫杉醇對(duì)以上兩類(lèi)細(xì)胞的抑制率和24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)，確定藥物最適作用濃度和時(shí)間。抑制率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Hoechst 33258熒光染色法觀察肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 取出蓋玻片浸泡于75%的乙醇中，30 min后酒精燈過(guò)火滅菌。滅菌好的蓋玻片置于6孔板內(nèi)。將肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞分別制備成單細(xì)胞懸液，以4.5×108·L-1接種于6孔板。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將以上兩類(lèi)細(xì)胞分別分為2組：陰性對(duì)照組與紫杉醇組(n=5)。陰性對(duì)照組在含10% FBS的DMEM-HG培養(yǎng)液中培養(yǎng)；紫杉醇組加入終濃度為5、10、20、40、80 μg·L-1的紫杉醇，藥物處理24 h后, 棄去各孔培養(yǎng)液，PBS液充分洗滌3遍，取出蓋玻片放入玻璃皿，浸泡于丙酮中固定30 min。PBS液洗3遍，每次2 min，避光加入1 mL Hoechst 33258染色液，染色15 min。吸棄染色液，PBS液洗3遍，每次5 min。封片，紫外光激發(fā)波長(zhǎng)約340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)約460 nm，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞周期的影響 取肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞分別制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為4.5×108·L-1，800 r·min-1離心10 min，收集細(xì)胞。用4℃的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并緩滴4℃無(wú)水乙醇，PBS與無(wú)水乙醇的比例為3 ∶7，每隔15 min搖1次，固定2 h。以800 r·min-1離心10 min，收集細(xì)胞。加入4℃ PBS液重懸，洗滌離心沉淀2次，然后向細(xì)胞沉淀中加入150 μL PI染液，4℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)各周期的百分率。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞凋亡的影響 將肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞分別制備成單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，加入Binding Buffer 100 μL重懸細(xì)胞，然后依次加入Annexin-V-FITC和PI染液各5 μL，輕柔吹打混勻，室溫避光染色15 min，再加入Binding Buffer 450 μL吹打混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 1的MTT結(jié)果顯示，紫杉醇(5、10、20、40、80 μg·L-1)組分別處理肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞24、48、72 h后，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞增殖均有抑制作用，與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制效果明顯高于原代肝細(xì)胞。肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率隨著紫杉醇濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增高；相同紫杉醇濃度下不同時(shí)間的抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用具有濃度時(shí)間依賴(lài)性，對(duì)于原代肝細(xì)胞呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，但無(wú)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

2.2紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響紫杉醇(5、10、20、40、80 μg·L-1)分別處理肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞24 h后，Hoechst 33258染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到對(duì)照組肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞分布均勻，呈淡藍(lán)色；而紫杉醇分別作用兩組細(xì)胞后，可見(jiàn)細(xì)胞核呈折光性強(qiáng)的亮藍(lán)色小點(diǎn)、細(xì)胞核濃染、形態(tài)不規(guī)則，呈半月形或者圓形，可見(jiàn)到凋亡小體。隨著紫杉醇濃度增高，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，表明紫杉醇可濃度依賴(lài)性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞凋亡。且紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡能力高于原代肝細(xì)胞(Fig 2)。

2.3紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞周期的影響紫杉醇作用肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞24 h均能改變細(xì)胞周期，與陰性對(duì)照組相比，均能提高G2/M期細(xì)胞比例(P<0.05)，且阻滯作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。紫杉醇能明顯提高肝癌細(xì)胞HepG2 G2/M 期比例，G0/G1期細(xì)胞比例降低(P<0.05)，S期細(xì)胞變化不大(P>0.05)。見(jiàn)Fig 3。

2.4紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞凋亡的影響不同濃度紫杉醇分別作用肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞24 h后，均能誘導(dǎo)兩種細(xì)胞發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果見(jiàn)Tab 1，兩組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可知，紫杉醇誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡的程度不同，紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率明顯高于原代肝細(xì)胞，且隨著紫杉醇濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。

Tab 1 Comparison of apoptotic rates between HepG2 cells and hepatocytes treated by different concentrations

*P<0. 05vsHepG2 group

Fig 1 Inhibitory effects of paclitaxel on HepG2 cells (A) and hepatocytes(B) at 24 h, 48 h and 72

*P<0.05vscontrol group(24 h);△P<0.05vscontrol group(48 h);#P<0.05vscontrol group(72 h)

Fig 2 Effect of paclitaxel on apoptosis morphology of HepG2 cells and hepatocytes(×200)

A：Control group of hepatocytes;B：Hepatocytes injured by paclitaxel 20 μg·L-1for 24 h; C：Hepatocytes injured by paclitaxel 80 μg·L-1for 24 h;D：Control group of HepG2 cells;E：HepG2 cells injured by paclitaxel 20 μg·L-1for 24 h;F：HepG2 cells injured by paclitaxel 80 μg·L-1for 24 h.

Fig 3 Effect of paclitaxel on cell cycle of HepG2 cells and

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

紫杉醇是廣西特色抗腫瘤中藥，具有廣譜抗癌活性。目前已廣泛應(yīng)用于治療乳腺癌、肝癌、肺癌等[7-8]。周艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損害正常人體細(xì)胞，造成不良反應(yīng)甚至死亡。本研究小組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致。由于肝細(xì)胞癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率連續(xù)攀升，已成為廣西居民健康頭號(hào)殺手[10-11]。為此，如何最大程度的發(fā)揮紫杉醇抗癌作用且使藥物的毒副作用降到最低，是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

本研究通過(guò)一定濃度梯度紫杉醇(5、10、20、40、80 μg·L-1) 分別培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞24、48、72 h，對(duì)其抑制增殖及其凋亡作用進(jìn)行了對(duì)比研究。MTT結(jié)果表明，紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞增殖均有抑制作用，且紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制效果明顯高于原代肝細(xì)胞。同時(shí)我們觀察到紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用具有濃度時(shí)間依賴(lài)性，這與吳裕文等[12]報(bào)道紫杉醇對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且具有濃度依賴(lài)性的結(jié)果一致。孫煒等[13]也報(bào)道了紫杉醇能明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈明顯量效關(guān)系。而對(duì)于原代肝細(xì)胞，隨著紫杉醇質(zhì)量濃度增高，抑制率逐漸增高，呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，但無(wú)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

Hoechst 33258染色觀察紫杉醇對(duì)兩種細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞都可出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞核呈折光性強(qiáng)的亮藍(lán)色小點(diǎn)、細(xì)胞核濃染、形態(tài)不規(guī)則，呈半月形或者圓形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，紫杉醇可使肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞阻滯于G2/M期，改變了肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的周期，且隨著紫杉醇濃度的增高，G2/M期細(xì)胞所占比例也隨之升高。有研究表明，紫杉醇抑制腫瘤細(xì)胞的分裂及增殖，使腫瘤細(xì)胞同步為G2/M期，從而發(fā)揮抗癌作用[14]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉醇抑制肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的增殖是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯完成的。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。但對(duì)兩種細(xì)胞凋亡的程度不同，紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率明顯高于原代肝細(xì)胞，且隨著紫杉醇濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。由此可推測(cè)，紫杉醇對(duì)于抑制肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的增殖抑制作用，和改變細(xì)胞周期比例及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用相關(guān)。有研究認(rèn)為，肝癌細(xì)胞增殖的抑制和癌細(xì)胞周期的改變以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡是目前抗肝癌的一種治療手段[15]。另外，我們可以觀察到相同濃度下，紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的凋亡率差異較大。猜測(cè)紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的作用基因或者信號(hào)途徑可能存在差異性，如果可以區(qū)分紫杉醇在對(duì)這兩種細(xì)胞凋亡過(guò)程中的差異，便利于在臨床上更好的運(yùn)用這類(lèi)藥物，能夠最大限度發(fā)揮其作用，有效減少或者消除自身毒副反應(yīng)，增加紫杉醇抗癌效果，從而提高臨床療效。這是我們后期研究的方向。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和原代肝細(xì)胞的毒性作用的確存在差異性，此差異性為紫杉醇在腫瘤防治的研究方面具有重要的意義。另外，本研究從細(xì)胞周期阻滯方面初步探索了紫杉醇抑制肝癌細(xì)胞增殖及自身毒副作用肝細(xì)胞損傷的機(jī)制，以期為紫杉醇臨床用藥提供可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本文全部實(shí)驗(yàn)均在廣西科技大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，特此致謝！)

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