蔡茜茜 ，袁勇，余震，裴東輝，黃雷，周巍

重金屬污染尤其是土壤重金屬污染已成為危害全球環(huán)境質(zhì)量以及人類生存和發(fā)展的主要問題之一（陳欣瑤等，2017）。工業(yè)生產(chǎn)過程中未能對重金屬進行合理處理，使其通過各種途徑排放到環(huán)境中，是土壤重金屬污染的主要來源（Tapase et al.，2017；劉慶，2008）。受到重金屬污染的土壤，往往富集多種耐重金屬的微生物（Gupta et al.，2017），它們可通過生物固定、轉(zhuǎn)化、溶解、氧化還原或吸附等方式影響土壤重金屬的毒性及其遷移與釋放（Pacwa et al.，2018；楊金水等，2017）。由于土壤微生物對重金屬脅迫具有敏感性，可通過微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來反映土壤的健康狀況（陳欣瑤等，2017）。土壤重金屬污染與微生物群落之間的關(guān)系也一直是土壤重金屬污染生態(tài)學(xué)研究的熱點問題（劉云國等，2007）。因此，從微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性、均勻性方面揭示土壤功能，能深刻闡明土壤微生物對重金屬脅迫的敏感程度及其變化趨勢，為改進土壤微生物修復(fù)重金屬污染技術(shù)提供理論依據(jù)。

本研究主要對錳化廠受重金屬污染的土壤進行研究分析，該工廠歷史悠久，在過去生產(chǎn)中沒有采取有效環(huán)保措施，致使重金屬泄露（熊云武等，2017）。本研究主要分析該錳化廠重金屬錳（Mn）、鉻（Cr）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（Zn）、鎘（Cd）、汞（Hg）、鉛（Pb）污染的土壤剖面分布情況，探索錳化廠周邊污染土壤中重金屬的垂直分布機理，為防止該污染對地下水造成污染提供科學(xué)依據(jù)。長時間受重金屬污染的錳化廠的土壤中，存在大量具有抵抗和轉(zhuǎn)化重金屬的潛在高效的微生物資源，因此本研究還分析了土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)的剖面變化情況，旨在揭示土壤微生物與土壤重金屬之間的關(guān)系，為抗重金屬優(yōu)良菌種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集及樣品處理

錳化廠位于廣東省東北部，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，全年氣溫高，光照充足，雨水豐富，年均氣溫21.7 ℃，年均降水量1289.3 mm。采取鉆孔、多點混合取樣法（同一采樣單元采 5～10個樣品）對錳礦尾渣堆放區(qū)周圍污染點進行垂直深層（＞0.2 m）取樣（程東祥等，2009），深度分別為0.3～0.5、1.0～1.5、2.0～2.5、3.0～3.5 m，并且對應(yīng)編號為 H1、H2、H3和 H4。采集的土樣帶回實驗室并儲存于-20 ℃待后續(xù)實驗與分析。

1.2 土樣化學(xué)性質(zhì)測試方法

將采集的樣品進行風(fēng)干，研磨后過100目篩，干燥保存待理化性質(zhì)分析。以下測試每個樣品做 3個平行。

重金屬測試消解方法參考《土壤和沉積物王水提取金屬元素-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（HJ 803—2016，中華人民共和國環(huán)境保護部，2016）。用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS/CASCQTSA0004）進行檢測。

pH的測定參考《土壤pH的測定方法》（NY/T 1377—2007，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2007），用pH計（PHS-25型數(shù)顯pH計）測量。

1.3 土壤總DNA的提取

土壤DNA提取采用土壤微生物DNA強力提取試劑盒（Power Soil? DNA Isolation Kit）提取。提取后，使用質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂凝膠電泳檢測DNA提取成功與否。每個樣品進行3個重復(fù)，提取后置于離心管中，-80 ℃條件下保存待生物檢測。

1.4 群落分析（Caporaso et al.，2010）

16 rDNA測序采用Hiseq Rapid SBS kit v2試劑盒，借助Illumina測序分析平臺研究土壤微生物群落組成和多樣性，并在門、綱、目、科、屬水平上，分析比較該污染區(qū)域土壤垂直方向上微生物群落組成的變化。文庫構(gòu)建使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit。

1.5 土壤質(zhì)量評價及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.5.1 內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)

土壤質(zhì)量評價中的重金屬評價參考《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準》（GB15618—1995，國家環(huán)境保護總局，1995）中的二級標(biāo)準，該標(biāo)準為保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，維護人體健康的土壤限制值。采用內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)法可以大體確定重金屬污染程度（王振中等，1994）：

式中，P為綜合污染指數(shù)；n為土壤中污染物質(zhì)的種類數(shù)；Pi為單項污染指數(shù)（張金蓮等，2015）；Ci為污染物實測值；Si為污染物評價標(biāo)準。污染級別的評價標(biāo)準為：P＜1.0，未污染；1.0＜P＜2.0，輕污染；2.0＜P＜3.0，中污染；P＞3，重污染。根據(jù)該方法可判別該錳化廠的主要污染因子及土壤受重金屬污染的程度。

1.5.2 顯著性分析

采用 SPSS（Statistical product and service solutions）對垂直方向上的受試土壤性質(zhì)進行顯著性相關(guān)分析。對于兩變量之間，r值代表假設(shè)檢驗的顯著水平：r＜0.01，兩者呈極顯著相關(guān)；0.01＜r＜0.05，兩者呈顯著相關(guān)；r＞0.05，無顯著相關(guān)關(guān)系。其中，相關(guān)性系數(shù)p代表相關(guān)程度：∣p∣≥0.8，兩變量間高度相關(guān)；0.5≤∣p∣＜0.8時，中度相關(guān)；0.3≤∣p∣＜0.5，低度相關(guān)；∣p∣＜0.3，基本不相關(guān)。

1.5.3 典范對應(yīng)分析

以微生物屬分類分別與采樣點、重金屬含量作為數(shù)據(jù)來源，采用Canoco 4.5對錳化廠土壤重金屬和群落種群進行典型對應(yīng)分析（Canonical correspondence analysis，CCA），步驟如下：（1）通過去趨勢對應(yīng)分析（Detrended correspondence analysis，DCA）得到排序軸梯度長度，長度小于3或介于3～4之間則選用線性模型CCA分析；（2）以微生物豐度為物種數(shù)據(jù)，以各重金屬含量為環(huán)境數(shù)據(jù)，導(dǎo)入軟件，進行CCA分析；（3）運用CanoDraw繪制微生物與重金屬的CCA二維排序圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 錳污染土重金屬含量及污染評價

表1所示為錳化廠污染土壤樣品的特性及重金屬含量測試結(jié)果，結(jié)果表明，該污染地不同深度的土壤均為酸性，pH值介于4.71～5.14之間。錳（Mn）在土壤3.5 m以上深度的含量均遠遠超過廣東土壤背景值，其中2.5 m以上土壤Mn含量是背景含量的兩三百倍，已遠遠超出正常范圍，能直接對人體造危害。鉻（Cr）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（As）、鎘（Cd）、汞（Hg）、鉛（Pb）等重金屬元素也有不同程度的污染，3.5 m以上土壤重金屬濃度均大大超過了土壤背景值，說明該錳化廠在過去生產(chǎn)中沒有采取有效環(huán)保措施，以上重金屬元素超標(biāo)主要來自外部非自然條件的長期累積。同時，該區(qū)重金屬污染中，只有Cr、Ni、Hg符合二級土壤質(zhì)量標(biāo)準，其他重金屬均不同程度地超過了該標(biāo)準。對于重金屬污染的部分，H1～H4綜合污染指數(shù)分別為12.66、9.650、1.400和0.560。結(jié)果表明，H1、H2屬于重度污染，其中，Cu（P=27.600、17.200）、Zn（P=14.400、16.200）、As（P=28.400、15.950）、Cd（P=17.200、16.400）和 Pb（P=11.800、10.660）單因子污染指數(shù)已達到重度污染程度，對土壤環(huán)境質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的危害；H3為輕度污染，其中，Cu（P=1.500）、As（P=1.820）、Cd（P=1.550）單因子污染指數(shù)為輕度污染，Zn（P=3.500）單因子污染指數(shù)為重污染；H4為影響較小的未污染區(qū)，其中Zn（P=1.210）單因子污染指數(shù)為輕污染程度。由此可見，該錳化廠土壤存在嚴重Mn污染，在土壤深度3.0 m以上還伴有多種重金屬復(fù)合污染，對該區(qū)土壤生態(tài)環(huán)境存在潛在威脅。

表1 錳污染土壤樣品特性及重金屬含量Table 1 The characteristics and concentration of heavy metals in manganic contaminated soil mg?kg-1

從以上污染元素在土壤剖面中最大值的分布可以看出，對于污染歷史悠久的錳化廠來說，表層Mn、Cu、Zn、Pb含量明顯高于深層，表明這4種元素主要集中在土壤表層，向下遷移的程度較低，這可能與這幾種元素在土壤中的有效性程度較低有關(guān)。運用SPSS對以上元素含量與所處的深度進行相關(guān)性分析能更加明確該區(qū)重金屬的垂直遷移規(guī)律。其中，Mn（r=0.029，p=-0.971）、Ni（r=0.041，p=-0.959）、Cu（r=0.043，p=-0.957）、As（r=0.049，p=-0.951）與土壤深度呈顯著負相關(guān)，說明以上元素隨采樣深度增加，其全量逐漸減少，且遞減規(guī)律顯著；Cr、Zn、Cd、Hg以及Pb隨采樣深度的增加其全量呈上下波動狀態(tài)或相關(guān)性不顯著。

2.2 不同程度污染土壤中微生物多樣性及群落組成分析

2.2.1 微生物多樣性分析

微生物對環(huán)境擾動（污染）十分敏感，不同種類微生物對環(huán)境擾動的敏感程度不同，因此重金屬污染可能引起微生物的種類組成和豐度發(fā)生明顯變化。經(jīng)測序獲得各采樣土層細菌的豐富度和多樣性指數(shù)（表 2），可見：（1）chao1數(shù)及 ACE顯示H1～H3細菌物種總數(shù)隨著深度增加而減少，而H4物種總量最高，結(jié)合4個土壤深度重金屬污染情況可知，土壤重金屬含量與微生物數(shù)量大體呈負相關(guān)，與李小林等（2011）報道的重金屬污染程度與土壤微生物數(shù)量呈負相關(guān)的結(jié)論一致；（2）Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)顯示，微生物群落多樣性及均勻性總體上隨著取樣深度增加而有所減少，與文獻報道一致，土壤綜合污染較輕時土壤微生物多樣性指數(shù)較高，隨著重金屬綜合污染指數(shù)的增加，達到中度到高度污染時，微生物多樣性指數(shù)迅速下降（楊濟龍等，2003）。

表2 4個采樣點的錳污染土高通量測試多樣性指數(shù)Table 2 Phylotype richness and diversity estimators of the bacterial communities in four sampling points of manganic contaminated soil

2.2.2 微生物群落組成分析

圖1 不同深度的錳污染土的群落組成分析Fig. 1 Microbial community structures analysis associated with vertical soil profile of manganic contaminated soils：the phylogenetic distributions

不同程度污染土壤中微生物群落組成分析如圖1，圖中展示了科和屬水平中豐度大于1%的群落組成。微生物結(jié)構(gòu)和豐度分析表明，土壤剖面上不同位置的重金屬含量不同致使所含微生物結(jié)構(gòu)、分布和豐度有一定差異性。通過在屬水平的細菌多樣性比較，能夠初步確定各個土壤深度的優(yōu)勢菌屬，Sphingomonas在錳化廠重金屬污染的樣品中的豐度最高，而且分布較廣泛，之前有報道稱重度污染土壤中Sphingomonas為優(yōu)勢菌（丁淑蘭，2015），對 Zn（王慧萍等，2010）、Cd（Sun et al.，2010）、As（田海霞，2014）等具有抗性，能通過細胞吸附作用降低環(huán)境重金屬濃度（Chen，2012）。其次，Pseudomonas和Methylobacterium含量也較高，有研究者在土壤中接種 Pseudomonas，顯著增加了生物有效態(tài)Cr、Cd的濃度（Braud et al.，2008）；也有研究者以該菌作為生物吸附劑處理含 Cu2+或Ni2+城市廢水，使重金屬含量降低至微量級（吳曉林等，2004）；同時，Pseudomonas對Pb也具有抗性（譚貴娥等，2008）。Methylobacterium 對環(huán)境的適應(yīng)力也很強，被建議應(yīng)用于修復(fù)Cd污染的土（陳美標(biāo)等，2012）；也被認為具備還原土壤中Cr6+的能力，被鑒定為六價鉻耐受菌（肖文丹等，2017）；能影響土壤中有效態(tài)Cd含量，提高植物對Cd的修復(fù)作用（鄧平香，2016）。在科水平豐度圖中，除了以上豐度較高菌所屬科，Oxalobacteraceae在H2～H4取樣點豐度較高，有報道稱草酸桿菌在Cu污染土壤中為優(yōu)勢菌，并能參與土壤反硝化過程（Feng et al.，2012），對降低植物根際銅毒及維持氮素循環(huán)具有重要作用（Gaspar et al.，2016）。再者，在H1取樣點生物群落中，Hyphomicrobiaceae豐度很高，該菌在有氧條件下，可同時參與 Fe、Mn和氨氮的去除過程（Gaspar et al.，2016），因此生絲微菌在H1中的豐度高可能是由于所處深度含氧量較其他深度高。

2.2.2.1 顯著性檢驗結(jié)果

以上微生物群落分析表明，錳化廠污染土壤中的微生物大部分與重金屬的脫毒轉(zhuǎn)化過程相關(guān)，同時隨土壤深度的變化而發(fā)生演替。運用SPSS對錳化廠高錳高重金屬污染土壤中優(yōu)勢種群與錳等重金屬各環(huán)境因子進行相關(guān)性分析，相關(guān)性大小可以反映微生物種群對土壤環(huán)境中重金屬含量變化敏感程度，相關(guān)性越大，則微生物對其變化越敏感（程東祥等，2009）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sphingomonas、未分類Acidithiobacillaceae與多種重金屬呈顯著負相關(guān)，相關(guān)性分別為 Mn（r=0.038，0.043；ρ=-0.957，-0.957）、Ni（r=0.017，0.016；ρ=-0.983，-0.984）、Zn（r=0.050，0.050；ρ=-0.950，-0.950）、Cd（r=0.049，0.049；ρ=-0.951，-0.951），說明雖然 Sphingomonas作為錳化廠污染土壤中的優(yōu)勢菌，對重金屬重度污染區(qū)H1、H2微生物有一定的毒害作用，可通過適當(dāng)提高土壤中 Sphingomonas的相對豐度來提高土壤抵抗外界重金屬污染的能力，從而使重金屬脅迫下的土壤保持相對穩(wěn)定；未分類Acidithiobacillaceae具有脫硫功能，常被用于金屬電鍍污泥的生物處理過程，可釋放污泥中有害重金屬元素（Bayat et al.，2010）。Lachnospira、未分類Bacteroidaceae、未分類Ruminococcaceae、未分類Hyphomicrobiaceae與土壤中 Hg含量呈顯著負相關(guān)，r分別為 0.046、0.002、0.032、0.007，p 分別為-0.954、-0.998、-0.968、-0.993，說明以上微生物隨 Hg含量的變化趨于一致，可作為Hg含量的指示性菌種。

2.2.2.2 不同土壤深度微生物群落與重金屬典范對應(yīng)分析

通過對微生物群落進行 DCA排序，決定采用何種排序模型來分析不同采樣深度土壤微生物與重金屬間的關(guān)系。排序后得到排序軸的梯度長度為0.473（＜3），因此可采用CCA線性模型進行分析，得到重金屬對微生物豐度差異性解釋量（見表3）。微生物豐度在第一、第二軸的解釋量分別為84.6%和13.5%，前兩軸可保留微生物豐度數(shù)據(jù)總方差的98.1%，且微生物豐度與重金屬含量關(guān)系的累積解釋量為98.1%。由此可知，大部分微生物豐度情況可被本研究所選的9種重金屬所解釋，且第一軸起決定性作用。

由表4可知，CCA第一排序軸與Ni、Zn、Cd、Pb、Mn的相關(guān)性較高，相關(guān)系數(shù)分別為-0.9693、-0.9517、-0.9197、-0.9140；第二排序軸與 Hg的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為-0.8168；第三排序軸和第四排序軸反映的重金屬環(huán)境因子不明顯，以上結(jié)果表明錳化廠污染土壤中影響微生物群落的重金屬主要為Ni、Zn、Cd、Pb、Mn、Hg，與顯著性分析結(jié)果基本一致。

表3 重金屬對微生物差異性解釋變量典范對應(yīng)分析Table 3 CCA of heavy metals and microorganisms

表4 重金屬與排序軸的相關(guān)性Table 4 Correlationship between soil heavy metals and the environmental axes

CCA將微生物群落和重金屬排序表示在一個圖上（圖 2b），重金屬用帶箭頭的連線表示，箭頭的長度代表著該金屬與微生物相關(guān)程度的大小，三角符號到箭頭的垂直距離代表該微生物受重金屬影響程度的大小，兩個箭頭之間的夾角余弦值代表著兩種重金屬間相關(guān)性程度，箭頭和排序軸的夾角代表重金屬與排序軸相關(guān)性。由圖2b可知，As、Cu、Mn、Pb、Cd、Ni、Zn箭頭間夾角較小，它們彼此之間有很強的關(guān)聯(lián)性，表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系，與其在土壤中的垂直分布情況具有一致的趨勢，從而可以判斷出它們在土壤中的遷移速率具有相關(guān)性，或它們影響土壤微生物群落方面可能表現(xiàn)出協(xié)同作用；Sphingomonas和Burkholderia與Cr箭頭位于同一象限，說明這兩種菌受 Cr的影響較大，且呈正相關(guān)，同理，Enterobacter、Pseudomonas和 Janthinobacterium 與Hg正相關(guān)，Defluviicoccus和Methylobacterium與As、Cu、Mn、Pb、Cd、Ni、Zn 呈正相關(guān)。Enterobacter、Pseudomonas、Janthinobacterium、Methylobacterium 4種菌彼此之間的關(guān)聯(lián)性較好，且它們到重金屬箭頭的垂直距離相對較短，說明這 4種菌受重金屬影響較大，由圖2a可知，這4種菌在H3取樣點出現(xiàn)的概率大于其他采樣點，因此在分離重金屬降解菌時可以選擇 H3深度下的土壤作為研究對象。通過CCA排序圖上重金屬箭頭的象限分布與采樣點關(guān)于微生物群落的分析看出，錳化廠土壤屬于多種重金屬復(fù)合污染土壤，H3位置易富集重金屬抗性菌，可為尋找重金屬污染的“核心微生物”奠定一定的理論與實驗基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以廣東省某錳化廠受重金屬污染土壤為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度進行分析，以探究不同深度重金屬污染下土壤微生物的變化。

圖2 取樣點與微生物（a）或微生物與重金屬關(guān)系（b）的典范對應(yīng)分析排序圖Fig. 2 Biplot of CCA for (a) sampling point and microorganisms; (b) microorganisms and heavy metals

（1）對錳化廠土壤污染評價：各采樣點土壤中Mn、Cr、Ni、Cu、Zn、As、Cd、Hg 和 Pb 均超過廣東省土壤相應(yīng)背景值。土壤深度1.5 m以上屬于重金屬重度污染，其中Cu、Zn、As、Cd、Pb單因子污染指數(shù)已達到重度污染；土壤深度 2.0～2.5 m屬于重金屬輕度污染，其中Cu、As、Cd單因子污染指數(shù)為輕度污染，Zn單因子為重度污染；深度3.0～3.5 m屬于未污染區(qū)。Mn、Ni、Cu、As含量與土壤深度呈負相關(guān)，且遞減規(guī)律顯著。

（2）顯著性分析結(jié)果：Sphingomonas、未分類Acidithiobacillaceae與 Mn、Ni、Zn、Cd呈顯著負相關(guān)；Lachnospira、未分類Bacteroidaceae、未分類Ruminococcaceae、未分類Hyphomicrobiaceae與土壤中Hg含量呈顯著負相關(guān)。

（3）CCA分析結(jié)果：Sphingomonas和Burkholderia受 Cr的影響較大，且呈正相關(guān)；Enterobacter、Pseudomonas和Janthinobacterium與Hg呈正相關(guān)，Defluviicoccus和 Methylobacterium與 As、Cu、Mn、Pb、Cd、Ni、Zn呈正相關(guān)；Enterobacter、Pseudomonas、Janthinobacterium、Methylobacterium 4種菌彼此之間的關(guān)聯(lián)性較好，且4種菌受重金屬影響較大；H3位置較易富集重金屬抗性菌。

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