陳長(zhǎng)春 周勤 尹曉娟

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)具有多向分化和自我更新功能，目前NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病主要采用NSCs移植和誘導(dǎo)自身的NSCs增殖分化兩種方法[1-2]。人類采用NSCs治療的疾病越來(lái)越多，基礎(chǔ)研究采用動(dòng)物和細(xì)胞模型模擬人類缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)進(jìn)行模式研究，目前，有很多建立缺氧NSCs模型的方法[3-4]，但由于不同的研究單位條件不同，有些方法對(duì)設(shè)備要求高，造價(jià)也高，因而不能普遍實(shí)用。若能尋找一種要求的設(shè)備簡(jiǎn)單、成本又低、操作簡(jiǎn)單而有效方法，那將是人類的福氣。為此，本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)及自制缺氧盒等技術(shù)，建立新生鼠(sprague dawley，SD)的NSCs缺氧細(xì)胞模型，旨在為開(kāi)展NSCs與HIBD的相關(guān)研究提供新思路。

材料與方法

1.材料：健康新生1 d體重分別為8 g、9 g的SD大鼠2只，雌雄不限，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(SCXK-(軍)-2012-0004)。95% N2+ 5% CO2的混合氣體(北京兆格氣體科技有限公司)，兔抗大鼠Nestin單克隆抗體(Santa)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、N2、新生的小牛血清(GibcoBRL)、B27、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12，SP通用抗體試劑盒，DAB試劑盒、細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)由碧云天公司提供，DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基(Neuronbc)，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；樂(lè)扣矩形保鮮盒(HPL825-CHM)，二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)，迷你離心機(jī)(昊諾斯生物科技有限公司，10512425)，搖床(其林貝爾，TS-1000)。

2.方法：

(1)分離SD乳鼠的海馬組織。SD鼠用乙醚麻醉，脫頸處死，放入75%乙醇中浸泡消毒，移至超凈工作臺(tái)上，取出海馬，將海馬組織移入另一只冰浴的盛有D-hank′s液的平皿剪碎吹打，用200目鋼絲網(wǎng)過(guò)篩，至10 ml試管中，加入0.25%的胰蛋白酶3 ml，放入37℃水浴箱水浴5 min，消化并充分吹打，用胎牛血清終止消化，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心8 min，去除上清，留取管底白色沉淀物，即單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(2)NSCs體外培養(yǎng)及鑒定。參照文獻(xiàn)[2]NSCs體外培養(yǎng)技術(shù)、鑒定方法，將獲得的單細(xì)胞加入含血清培養(yǎng)基，充分吹打混勻，培養(yǎng)24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按5×105/ml細(xì)胞密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶，37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，5～7 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將傳代第3代NSCs一部分按5×105活細(xì)胞/毫升的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶，一部分細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，用于免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。取出細(xì)胞爬片放入6孔板內(nèi)，漂洗，加入4%多聚甲醛溶液、0.5% Txiton X-100 溶液、3%H2O2，血清封閉，加入一抗Nestin(1:100)，陰性對(duì)照用PBS代替，放入濕盒37°C孵育1-2 h，加入二抗，DAB顯色，鏡下觀察并攝片。

(3)制作NSCs缺氧細(xì)胞模型。缺氧培養(yǎng)盒制作，參照文獻(xiàn)[2]，并加以改良，通入的混合氣體密度相對(duì)較大，因此用鉆孔器在保鮮盒上外處(出氣孔)、里下位置(進(jìn)氣孔)分別鑿1個(gè)孔，兩個(gè)橡膠導(dǎo)管分別插入進(jìn)出口中，用透明膠帶嚴(yán)格固定封閉，進(jìn)氣孔通過(guò)吸氧管與濕化瓶連接，再通過(guò)橡膠導(dǎo)管與混合氣體瓶連接，并用透明膠帶嚴(yán)格固定封閉。將傳代的NSCs重懸，按密度為5×105活細(xì)胞/ml加至一次性培養(yǎng)皿中；缺氧組更換為無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，放入自制缺氧盒中；對(duì)照組培養(yǎng)基仍不含血清，移入37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。先用真空棒抽出裝置內(nèi)空氣，抽完空氣后立即夾住出氣孔的橡膠導(dǎo)管，將其輕輕插入測(cè)氧儀的氧電極導(dǎo)管，當(dāng)測(cè)氧儀顯示氧氣濃度<1%時(shí)，迅速打開(kāi)閥門通入95% N2+ 5% CO2的混合氣體，調(diào)節(jié)氣體流量為1 L/min，在每個(gè)時(shí)相點(diǎn)持續(xù)通氣，通過(guò)測(cè)氧儀持續(xù)監(jiān)測(cè)氧氣濃度，根據(jù)測(cè)氧儀顯示氧濃度結(jié)果，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)通入95% N2+5%CO2的混合氣體流量，使測(cè)氧儀顯示氧氣濃度<1%。選擇通氣體時(shí)間30 min、1 h及2 h為檢測(cè)時(shí)相點(diǎn)，在各時(shí)相點(diǎn)取出細(xì)胞在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8法檢測(cè)NSCs細(xì)胞活性，復(fù)氧同時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基。見(jiàn)圖1。

圖1 NSCs缺氧細(xì)胞模型裝置

3.NSCs細(xì)胞缺氧模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：缺氧后NSCs數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清楚，折光性減弱，胞體腫脹，甚至出現(xiàn)核固縮、細(xì)胞膜破裂；各時(shí)相點(diǎn)缺氧組和對(duì)照組細(xì)胞分別加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液，各組細(xì)胞在0.5 h、1 h、2 h等時(shí)相點(diǎn)行細(xì)胞染色，各時(shí)相點(diǎn)染色五次，記錄死亡細(xì)胞數(shù)；取出兩組部分細(xì)胞按2×104活NSCs/ml密度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，滴加100 μl，各時(shí)相點(diǎn)滴加五個(gè)孔，每個(gè)孔內(nèi)滴加10 μl CCK-8溶液充分混勻，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，打開(kāi)酶標(biāo)儀器，選擇450 nm波長(zhǎng)和630 nm參比波長(zhǎng)，記錄兩組光密度值(optical density，OD)。 兩組若在NSCs形態(tài)改變、臺(tái)盼藍(lán)死亡細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，以上三點(diǎn)中存在差異，則表明缺氧NSCs模型制作成功。

結(jié)果

1.NSCs細(xì)胞的形態(tài)：經(jīng)Nestin抗體鑒定該細(xì)胞為NSCs，見(jiàn)圖2。缺氧前NSCs細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，遮光性較強(qiáng)，邊界較清楚，缺氧后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，數(shù)量明顯減少，缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)破裂，皺縮，見(jiàn)圖3、圖4。復(fù)氧復(fù)糖72 h后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，數(shù)量減少，可見(jiàn)大小不等的克隆神經(jīng)球，見(jiàn)圖5。

2.各缺氧時(shí)相點(diǎn)臺(tái)盼藍(lán)NSCs計(jì)數(shù)：缺氧30 min NSCs死亡細(xì)胞數(shù)量(2.000±0.707)與對(duì)照組(2.200 ±0.837)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧1 h NSCs死亡細(xì)胞數(shù)量(9.200±2.387)與對(duì)照組(2.600 ±0.548)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧2 h NSCs死亡細(xì)胞數(shù)量(21.000±1.581)與對(duì)照組(1.800 ±0.447)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，死亡細(xì)胞數(shù)越多。

3.各缺氧時(shí)相點(diǎn)CCK-8法檢測(cè)NSCs活性：缺氧30 minNSCs活性與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧1 h、2 h NSCs的活性與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧1 h、2 h組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 NSCs細(xì)胞活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；組間比較，▲P<0.05

4.各復(fù)氧復(fù)糖時(shí)相點(diǎn)CCK-8法檢測(cè)NSCs活性：復(fù)氧復(fù)糖24 h缺氧組OD值(0.409±0.002)與對(duì)照組(0.486±0.002)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)氧復(fù)糖72 h缺氧組OD值(0.483±0.003)與對(duì)照組(0.511±0.002)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

目前，國(guó)內(nèi)外建立了多種細(xì)胞缺氧方法，化學(xué)性缺氧包括堿性焦性沒(méi)食子酸溶液、厭氧產(chǎn)氣袋等，堿性焦性沒(méi)食子酸溶液法的優(yōu)點(diǎn)是不與培養(yǎng)基接觸、同時(shí)清除培養(yǎng)盒及培養(yǎng)基中的氧，缺點(diǎn)是廢液可對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生污染、配制堿性液體時(shí)氫氧化鈉可對(duì)操作人員、物品等造成危害[3]。厭氧產(chǎn)氣袋法優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)產(chǎn)生壓差和高溫、廢棄物處理方便、無(wú)污染，但存在缺氧時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高的缺點(diǎn)[4]?；瘜W(xué)方法設(shè)備簡(jiǎn)單，制備迅速，但化學(xué)藥物不可避免會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，且與真實(shí)缺氧有一定差異[5]。物理性缺氧是將培養(yǎng)的細(xì)胞置于充有N2和C02混合氣體的低氧環(huán)境中培養(yǎng)。三氣培養(yǎng)箱具有精確控制培養(yǎng)環(huán)境中O2及CO2濃度、波動(dòng)幅度極小、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，但具有成本高、缺氧時(shí)間長(zhǎng)、占據(jù)一定空間等缺點(diǎn)[5]。

建立細(xì)胞缺氧模型的關(guān)鍵是控制作用時(shí)間、氧濃度，時(shí)間短、濃度低則達(dá)不到建模效果，時(shí)間長(zhǎng)、濃度高則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。低氧和缺氧對(duì)NSCs增殖及分化有不同的影響，NSCs處于相對(duì)低氧(氧濃度1%～8%)環(huán)境，3%～5%氧氣濃度能夠促進(jìn)NSCs增殖和分化；缺氧(氧濃度

本研究設(shè)置3個(gè)缺氧時(shí)相點(diǎn)，采用CCK-8法及臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性及死亡細(xì)胞數(shù)，當(dāng)缺氧30 min時(shí)，NSCs死亡細(xì)胞數(shù)及活性與對(duì)照組比較均無(wú)明顯變化；當(dāng)缺氧時(shí)間達(dá)到1 h、2 h，NSCs死亡細(xì)胞數(shù)及活性與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；故認(rèn)為缺氧1 h為建立NSCs細(xì)胞缺氧模型的最佳時(shí)間點(diǎn)，這樣既節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間又達(dá)到了實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

譚盛等[5]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧2 h可促進(jìn)NSCs增殖且存活率有一定增長(zhǎng)，而本實(shí)驗(yàn)缺氧2 h NSCs死亡細(xì)胞數(shù)增多且活性明顯降低；出現(xiàn)此相反結(jié)果的原因可能是：(1)本裝置內(nèi)氧濃度更低，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到缺氧效果；(2)DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基類似于活體發(fā)生低張性和循環(huán)性缺氧，而無(wú)糖Earle，S平衡鹽溶液適合與NSCs增殖；(3)成年大鼠海馬NSCs與生后1天大鼠NSCs生理狀況存在差異。本裝置采用真空棒抽氣法清除裝置內(nèi)的氧，這與譚盛等[5]除氧法相比，本方法明顯縮短清除氧氣的時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)裝置及方法具有經(jīng)濟(jì)、實(shí)用易操作、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、占據(jù)空間小、清洗方便、可重復(fù)使用、氧氣清除率高、穩(wěn)定性及安全性高等優(yōu)點(diǎn)，所以該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用易操作、儀器簡(jiǎn)單、效率及成功率高。

(圖2～圖5見(jiàn)封底)

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