孫軍營 林健靜 欒昕宇 王方曦 李國慶 張衛(wèi)飛 曾暉

（北京大學深圳醫(yī)院骨關節(jié)科，廣東 深圳 518036）

骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的嚴重影響患者日?；顒幽芰Φ穆灾職埿约膊　Ａ餍胁W調查結果顯示，OA的發(fā)病主要集中在老年人群，隨著年齡的增長，OA的發(fā)病率出現(xiàn)逐步遞增的趨勢[1,2]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)調查和統(tǒng)計顯示，全世界＞50歲人群中約50%患有OA，而在＞75歲人群中OA發(fā)病率為80%。在中國人口中，50歲以上人群中OA的發(fā)病率達60.70%，且這一數(shù)值以每年0.24%的速度急速攀升[3,4]。OA的發(fā)病與年齡因素高度相關，故老齡化被視為導致OA發(fā)生的最危險致病因素之一。

沉默信息調節(jié)因子1（sirtuin type 1,Sirt1）作為Sir2的同源體，含一個高度保守的催化核心序列，廣泛存在于哺乳動物染色質中，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）[5]，能通過不同的分子信號通路參與機體代謝、延長壽命、控制細胞分化、增殖、凋亡及抑制炎癥等生物反應[6,7]。白藜蘆醇（resveratrol,Res）是一種多酚類化合物，可從植物中提取得到，是現(xiàn)階段研究最廣泛的Sirt1特異選擇性激活劑，EX-527則是一種常用的Sirt1特異選擇性抑制劑。目前，Sirt1在OA中的作用越來越受到人們關注。近來研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，在OA累及的軟骨中，Sirt1的表達降低，同樣在Sirt1基因被敲除的小鼠中，OA的進展更快更嚴重。一系列研究表明，Sirt1能夠延緩OA的發(fā)展，起重要的保護作用。但其具體的作用機制尚不十分明確。

關節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質增生是OA的中心環(huán)節(jié)，而軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的異常改變是導致軟骨退變的重要原因之一[9-12]。故本研究擬通過體外分離并培養(yǎng)小鼠的膝關節(jié)軟骨細胞，分別加入Sirt1的激動劑和抑制劑，比較組別軟骨細胞Sirt1表達和軟骨細胞ECM合成及降解的情況，探究Sirt1對軟骨細胞ECM的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要試劑

5日齡C57BL/6J小鼠（北京大學/香港科技大學醫(yī)學中心，深圳醫(yī)院實驗動物中心），細胞培養(yǎng)基的改進型1640（Hyclone公司）；牛血清白蛋白（BSA）、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清（fetal bovine serun,FBS）（Gibco公司），雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、白藜蘆醇、EX-527、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）（Sigma公司）；TRE-trizol（Invitrogen公司），反轉錄試劑盒、熒光PCR試劑盒（TaKaRa公司），熒光定量PCR引物（生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成）；anti-Sirt1抗體、anti-CollagenⅡ 抗體（Abcam公司），二抗（碧云天公司）。

1.2 分離培養(yǎng)軟骨細胞及實驗分組

5只5日齡C57BL/6J小鼠被取出，脫頸處死，浸泡在75%酒精中消毒5 min，超凈臺無菌條件下小鼠雙后肢被眼科剪剪斷，剪取膝關節(jié)骨骺端的透明軟骨組織，沖洗3次PBS，利用眼科剪將軟骨組織剪成1 mm3大小的碎組織塊。用15 ml離心管裝碎組織塊，加入0.25%胰蛋白酶1 ml后，混勻充分，放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化45 min，加入1 ml含有10%FBS的1640培養(yǎng)液終止消化，進行5 min離心，1000 r/min，棄去上清液。然后加入1 ml無菌的0.2%Ⅱ型膠原酶，放置在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行37℃，5 h消化，然后加入含有10%FBS的1640培養(yǎng)液1 ml來終止消化，1000 r/min，離心5 min，棄去上清。將含有l(wèi)%鏈霉素/青霉素雙抗和10%FBS的1640培養(yǎng)基加入制成細胞懸浮液，根據(jù)4×105/ml的細胞密度，將軟骨細胞均勻接種在25 cm2大小的培養(yǎng)瓶中。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。每間隔2 d更換1次培養(yǎng)基，等到軟骨細胞融合度達75%以上，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，實驗細胞一般選取二代的傳代細胞。

細胞懸液濃度調整為1×104個/ml，6孔板中加入細胞懸液，2 ml/每孔，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。待細胞融合度約為80%時，隨機分為3組，并分別按以下方式處理：①空白對照組，僅加入DMSO干預36 h。②EX-527組，予以EX-527 干預 36 h（終濃度為 10 μmol/L）。③白藜蘆醇組,予以白藜蘆醇干預36 h（終濃度為100 μmol/L）。

1.3 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞

選取生長良好的軟骨細胞，將細胞懸液濃度調整為1×104個/ml，24孔板中進行爬片，1 ml細胞懸液加入到各孔后放置在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。利用PBS液漂洗3次，每次至少5 min，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS液再漂洗3次，每次5 min，然后甲苯胺藍溶液染色，在搖床上緩慢震蕩4 h，PBS液共洗3次，每次5 min，最后在室溫下放置至少10 min晾干，封片，進行顯微鏡下觀察。

1.4 II型膠原免疫熒光檢測

選取一些生長良好的軟骨細胞，將細胞懸液濃度調整為1×104個/ml，24孔板中進行爬片，1 ml細胞懸液加入到各孔后放置在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。利用PBS液漂洗3次，每次5 min，再用4%多聚甲醛固定15 min，PBS液繼續(xù)洗3次，每次5 min，5%BSA封閉液30 min封閉，加入Ⅱ型膠原一抗4℃過夜，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入Cy3標記山羊抗兔IgG（H+L）后室溫下放置30 min以上，進行熒光顯微鏡下觀察。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）

收集在不同實驗條件要求下進行培養(yǎng)的細胞，利用Trizol法分別提取各組細胞總RNA。利用反轉錄試劑盒（TAKARA公司）合成cDNA，根據(jù)目的基因退火溫度選擇三步法進行擴增，完成循環(huán)數(shù)40次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，根據(jù)熔解曲線判斷RT-PCR擴增產(chǎn)物的特異性。利用PrimerPremier 5.0軟件設計引物。引物序列如表1所示。

表1 實時定量聚合酶鏈反應引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，方差齊性檢驗后，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鏡下觀察小鼠膝關節(jié)軟骨細胞

倒置顯微鏡下顯示，在不同培養(yǎng)階段小鼠軟骨細胞生長特點也不同：①培養(yǎng)0 d的軟骨細胞尚未貼壁，呈圓形，大小均一，均勻懸浮在培養(yǎng)液中（圖1A）；②1 d后，細胞完全貼壁，細胞形態(tài)呈三角形、多角形，均勻散在生長于培養(yǎng)瓶底壁（圖1B）；③5 d后，細胞完全融合，呈現(xiàn)出“鋪路石”樣外觀，單層鋪滿于培養(yǎng)瓶瓶底（圖1C）。

2.2 細胞活性檢測

用臺盼藍染細胞，死細胞著藍色，活細胞不著色，從而可以區(qū)分死細胞與活細胞。原代軟骨細胞在未貼壁前檢測，活細胞率約90%。傳代后，軟骨細胞活性增高可達到95%以上。傳代次數(shù)越多，尤其在傳至6代以后，細胞活性出現(xiàn)明顯下降，細胞形態(tài)變化顯著，大小不均等且細胞內(nèi)出現(xiàn)有黑色顆粒。

圖1 鏡下觀察小鼠膝關節(jié)軟骨細胞（100×）

2.3 軟骨細胞HE染色和苯胺藍染色觀察

細胞核內(nèi)的染色質等酸性物質可與蘇木素結合呈現(xiàn)藍色，而細胞質中的堿性蛋白等物質可與伊紅結合呈現(xiàn)紅色，進而可區(qū)分細胞的形態(tài)結構。染色后可以觀察到軟骨細胞核為圓形或者橢圓形，呈藍色，胞質三角形或者多角形，呈粉紅色。甲苯胺藍為堿性染料,呈酸性的細胞核與其中有染色作用的陽離子相結合而被染為藍色；而胞質內(nèi)的異色性物質遇到甲苯胺藍可呈現(xiàn)出紫紅色，染色后可以看到呈現(xiàn)藍色的軟骨細胞細胞核和呈現(xiàn)紫紅色的軟骨細胞細胞質（圖2）。

2.4 軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定

Ⅱ型膠原由軟骨細胞分泌，是軟骨細胞的特異性標志，可以作為鑒定軟骨細胞的特異性指標[9]。如圖3所示，熒光顯微鏡下，軟骨細胞由于表達Ⅱ型膠原而被熒光染料染紅色熒光，軟骨細胞胞核被DAPI復染成藍色。細胞Ⅱ型膠原免疫熒光陽性率達90%以上，表明培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞，可以用于本次后續(xù)實驗。

2.5 RT-PCR檢測mRNA表達

與空白對照組比較，白藜蘆醇組，Sirt1基因表達上調，Sox9、聚蛋白多糖和II型膠原的表達增多，MMP-3、MMP-13和 ADAMTS-5的表達減少（P＜0.05）；EX-527組，Sirt1基因表達下降，Sox9、聚蛋白多糖和II型膠原的表達減少，MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達增多（P＜0.05，圖4～5）。

圖2 軟骨細胞HE染色和甲苯胺藍染色結果（200×）

圖3 軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定（400×）

3 討論

Sirt1是哺乳動物Sirtuin家族成員中目前研究最多的一種組蛋白去乙?；福饕植荚诩毎藘?nèi)，由500個氨基酸殘基組成，分子量為120 kDa，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)發(fā)揮生物學作用，其功能為催化蛋白賴氨酸的去乙?；?，調控許多下游目標基因的轉錄，進而發(fā)揮調節(jié)新陳代謝、抑制炎癥、抗衰老、抗凋亡等多個方面的生物學效應[13,14]。有研究表明Sirt1表達水平在OA關節(jié)軟骨中明顯降低，Sirt1可以影響OA發(fā)展[15,16]。

OA是一種慢性退行性疾病，在多種因素的共同作用下導致軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨三者降解和合成失衡，臨床病理特征是軟骨破壞和關節(jié)間隙變窄，其細胞學基礎則是軟骨ECM的改變[17,18]。目前國內(nèi)外對于OA的研究大多數(shù)著重于ECM合成與降解失衡而導致軟骨的破壞。

圖4 Sirt1、Sox9、聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原mRNA的相對表達量

ECM是軟骨細胞間的填充，也是軟骨組織的支架，可以通過細胞膜上的受體與軟骨細胞發(fā)生聯(lián)系，它對軟骨細胞的增值、遷移、細胞間信號的傳遞以及機械應力作用方面都發(fā)揮著重要作用[19,20]。ECM主要由膠原、聚蛋白多糖以及水構成，此外，還有少量的無機鹽以及溶菌酶和脂類。II型膠原是關節(jié)軟骨特有的膠原，占膠原總量的80%～95%，占軟骨干重的60%[21]，和其他膠原構成了ECM的纖維網(wǎng)狀結構，對關節(jié)的承受力和抗張力起到了至關重要的作用[22]。聚蛋白多糖約占軟骨濕重的5%～10%[23]，位于膠原的纖維網(wǎng)狀結構之間，保持軟骨組織的完整性，具有良好的親水性，對維持軟骨含水量起到重要作用，使軟骨具有良好的抗壓和抗沖擊能力。二者是關節(jié)軟骨的兩個主要成分，是軟骨細胞抵御和緩解外界機械壓力的主要保護屏障，它們由軟骨細胞合成和分泌[24]。同時軟骨細胞也會合成和分泌多種基質降解酶，導致ECM的降解[25]。其中基質金屬蛋白酶是軟骨ECM降解的主要介質，可與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起快速降解軟骨，MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的作用尤為顯著[26-28]。另外，Sox9是軟骨形成過程中一個十分重要的轉錄因子，該基因的突變或缺失可導致軟骨發(fā)育的異?；驀乐氐南忍煨约膊29]。因此，本研究采取檢測Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的mRNA水平來表示ECM的合成情況，檢測MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA水平來表示ECM的降解情況。

本研究通過分別加入Sirt1基因的激活劑白藜蘆醇和抑制劑EX-527的方法來調節(jié)Sirt1的活性，同時觀察軟骨細胞ECM合成特異性基因Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的mRNA表達水平以及降解特異性基因MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表達情況，從而探討Sirt1基因與軟骨細胞ECM之間的關聯(lián)情況。

圖5 MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5 mRNA的相對表達量

本研究結果顯示，激活Sirt1基因導致Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的表達明顯增加而MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達明顯減少，而抑制Sirt1基因導致Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的表達明顯減少而MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達明顯增多。該結果表明，Sirt1基因的活性與Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9以及MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達具有相關性即與軟骨細胞ECM之間具有相關性。當OA發(fā)生時，Sirt1基因的表達出現(xiàn)降低[30,31]，所以推測，低表達的Sirt1基因導致Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的表達明顯減少而MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達明顯增多，最終，軟骨細胞ECM合成減少同時軟骨細胞ECM降解增加，進而引起軟骨的破壞。所以，Sirt1基因能夠促進軟骨細胞ECM的合成并且減緩軟骨細胞ECM的降解，對關節(jié)軟骨起到保護作用。這說明Sirt1基因對OA的作用機制可能通過影響軟骨細胞ECM而實現(xiàn)，又為進一步研究OA的發(fā)病機制提供了一定的思路。然而Sirt1通過具體什么樣的途徑對軟骨細胞ECM發(fā)揮作用，本研究未能進行，需要進一步探索完善。另外，本實驗是在沒有任何炎癥因子刺激下探究Sirt1對軟骨細胞ECM的作用，而OA發(fā)生時軟骨細胞處于炎性條件下，所以在炎性條件下Sirt1能否對軟骨細胞ECM發(fā)揮同樣的作用也是需要進一步研究。

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