夏　飛， 李煜田， 汪夢雯， 楊　苗， 曾　橋， 秦俊哲

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安　710021)

0　引言

茯茶是黑茶精加工的一種，其外形整齊如磚片，內(nèi)質(zhì)金花普茂，菌香濃郁.開湯后色澤紅濃、香氣純正、滋味醇厚，具有消食健胃、降血壓、降血脂等保健效果，素來是邊疆地區(qū)牧民必不可少的日用飲品[1].隨著人們對自身保健的重視，茯茶因其特有的保健功效，近年來越來越受到人們的青睞，同時茯茶所特有的“金花”結(jié)構(gòu)，也引起了許多科研工作者的濃厚興趣.

茯茶中特有的“金花”，是一種由冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)形成的金黃色閉囊殼結(jié)構(gòu)(如圖1所示)，形似金黃色小花盛開，因而冠突散囊菌也被俗稱為“金花菌”.在茯茶加工過程中，經(jīng)特定工藝壓制成型的茯茶中的冠突散囊菌在一定的溫、濕度條件下形成“金花”的過程，被形象地稱為“發(fā)花”.從古至今，茯茶中“金花”的豐富度是判斷茯茶品質(zhì)的重要指標之一，因而茯茶中冠突散囊菌的快速大量生長也成為現(xiàn)代茯茶加工工藝改良的關鍵.

(a)茯茶中的“金花”　　(b) 閉囊殼結(jié)構(gòu)圖1　茯茶中特有的“金花”及冠突散囊菌的閉囊殼結(jié)構(gòu)

近年來，越來越多的研究者開始關注微生物在茯茶品質(zhì)形成過程中的作用，并開展微生物對茯茶品質(zhì)形成機制相關的研究[2-4].建立在傳統(tǒng)自然“發(fā)花”工藝基礎上的茯茶，其加工過程中微生物種類多而雜，茯茶發(fā)酵周期長且易染雜菌，導致產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，制約著茯茶品質(zhì)的提升.為提高茯茶的“發(fā)花”效果，已有研究者采用人工接種“發(fā)酵劑”的形式進行茯茶制備.茯茶“發(fā)酵劑”的研制是提高茯茶品質(zhì)的有效途徑之一.“發(fā)酵劑”即采用人工培養(yǎng)的方式，產(chǎn)生大量“金花菌”的菌絲或者孢子，在茯茶原料二次汽蒸后、制磚之前進行添加.秦俊哲等[5，6]通過接種茯茶發(fā)酵劑的方式進行茯茶加工，能明顯縮短茯茶“發(fā)花”周期，降低污染雜菌的概率，提高“發(fā)花”效率.然而，該茯茶“發(fā)酵劑”采用固態(tài)發(fā)酵手段制備，含有雜質(zhì)較多且制備過程中易污染雜菌.通過液體培養(yǎng)基在密閉環(huán)境中發(fā)酵則可避免其他微生物對發(fā)酵劑污染的問題.因此，從茯茶中分離“金花菌”并對其液體生長培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化從而獲得大量孢子和菌絲體的生長，為茯茶發(fā)酵劑的研制奠定堅實研究基礎就顯得尤為重要.

本研究從陜西涇陽出產(chǎn)的高品質(zhì)茯茶中分離“金花菌”，通過形態(tài)學及分子生物學方法進行初步鑒定；并對其菌絲體生長和孢子產(chǎn)生最適培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，為研制茯茶“發(fā)酵劑”奠定研究基礎.本研究對于茯茶發(fā)酵劑的研制，進而提高茯茶品質(zhì)具有重要的應用價值.

1　材料與方法

1.1　實驗材料與儀器

1.1.1菌株

菌株Eurotiumsp.JW043分離自陜西涇陽茯茶產(chǎn)品，經(jīng)純化鑒定后，保存于本研究室.

1.1.2試劑

硝酸銨、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸、乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等試劑均為分析純，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.真菌DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司.

1.1.3培養(yǎng)基

(1)改良馬丁培養(yǎng)基：單因素優(yōu)化培養(yǎng)實驗所用培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，每1 000 mL培養(yǎng)基組成為：碳源20.0 g、氮源2.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g.加超純水定容至1 000 mL，分裝，121 ℃高溫濕熱滅菌20 min.

(2)PDA培養(yǎng)基：用于“金花菌”分離、純化.葡萄糖20 g、去皮土豆200 g煮20 min后過濾留汁備用、瓊脂18 g(固體培養(yǎng)基時添加).加超純水定容至1 000 mL，分裝，121 ℃高溫濕熱滅菌20 min.

1.1.4儀器

粉碎機、渦旋振蕩儀、THZ-C恒溫震蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)、恒溫培養(yǎng)箱(江蘇太倉市實驗設備廠)、光學顯微鏡、PCR儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(復日科技).

1.2　研究方法

1.2.1菌株的分離及純化

將陜西涇陽茯茶使用茶針撬開后，取其中“金花”豐富的茯茶材料粉碎，取適量于無菌10 mL離心管中，加入5 mL無菌水置于渦旋振蕩儀上震蕩10 min，取上清稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基上.28 ℃靜置培養(yǎng)5天，挑取單菌落于PDA培養(yǎng)基上劃線，純化數(shù)次.

1.2.2菌株Eurotiumsp.JW043的鑒定

(1)形態(tài)學觀察：無菌條件下挑取菌種Eurotiumsp.JW043菌絲轉(zhuǎn)接至數(shù)個PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)5天后，選取菌斑生長良好的菌落進行平板觀察、拍照.

(2)轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)序列測序：無菌條件下刮取平板上單菌落菌絲體，采用天根真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA后，使用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[7]進行轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)序列(Internal Transcribed Spacer，ITS)擴增.PCR反應在25μL體系中進行，包括12.5μL的ExTaqDNA聚合酶預混液(Takara,Japan)，上下游引物各1μmol/L，1μL模板DNA，9.5μL超純水.PCR擴增溫度條件為:95 ℃預變性5 min，之后進行30個循環(huán)的擴增，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s以及72 ℃延伸1 min.循環(huán)結(jié)束后，最后72 ℃延伸10 min[8].PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳確認片段大小后，交生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析.測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)進行比對，并采用Mega軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，選用Neighbor-Joining繪圖算法，重復迭代1 000次[9].

1.2.3發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)碳、氮單因素條件篩選：對影響Eurotiumsp.JW043菌絲體生長和孢子產(chǎn)生的碳源和氮源分別進行篩選.每1 000 mL培養(yǎng)基中氮源為酵母浸膏2.0 g，分別測定20.0 g乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖及蔗糖對菌絲體生長和孢子產(chǎn)生量的影響；對于氮源的篩選，同樣每1 000 mL培養(yǎng)基中固定葡萄糖20.0 g為碳源，研究2.0 g硝酸銨、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸對菌絲體生長和孢子產(chǎn)生的影響.碳、氮單因素條件篩選培養(yǎng)基中均添加硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀0.1 g.將接種好的培養(yǎng)基于150 rpm，28 ℃搖床培養(yǎng)7天.之后，對發(fā)酵液中孢子數(shù)和菌絲濕重分別進行測定.

(2)正交試驗：在單因素篩選碳氮源實驗基礎上，選取蔗糖作為碳源、酵母浸膏作為氮源、MgSO4為無機鹽，采用正交設計助手(Orthogonality Experiment Assistant II，v3.1.1)軟件設計3因素3水平的正交試驗.按照正交實驗設置，配制好培養(yǎng)基后接種Eurotiumsp.JW043，于150 rpm，28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)7天.培養(yǎng)結(jié)束后，對發(fā)酵液中孢子數(shù)和菌絲濕重分別進行計數(shù)和濕重測定.

1.2.4孢子計數(shù)及菌絲體重量測定

孢子計數(shù)采用血球計數(shù)板方法進行.菌絲濕重的測定過程如下：發(fā)酵液中的菌絲體通過5 000 rpm離心10 min，采用去離子水清洗、再次離心去上清，重復2～3次之后，用吸水紙吸干多余水分后稱重即為菌絲濕重.

2　結(jié)果與討論

2.1　菌株形態(tài)學觀察及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

菌株Eurotiumsp.JW043在PDA固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2天后,可形成直徑約1 cm的菌落，菌落外圍有一圈白色至淺黃色菌絲體，內(nèi)部近于橄欖淺黃色(如圖2(a)所示).培養(yǎng)至第4天，邊緣顏色逐漸變深，中央部分顏色也逐漸加深，近于褐色(如圖2(b)所示).培養(yǎng)6天后中央部分變成棕色，菌落邊緣形成明顯棕色圈，色素在培養(yǎng)基上輻射面較大(如圖2(c)所示).培養(yǎng)至第8天，菌落直徑明顯增加，菌落中心呈現(xiàn)黑褐色，黑褐色外圍繞一圈明顯的黃色物質(zhì)，平板背面呈現(xiàn)深棕色(如圖2(d)所示).

(a)接種后2天　　　　(b)接種后4天

(c)接種后6天　　　　(c)接種后8天圖2　菌株Eurotium sp.JW043在PDA平板的生長情況

將菌株Eurotiumsp.JW043的轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示該菌株與數(shù)個Eurotiumcristatum菌株具有非常高的同源性.通過Mega構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株Eurotiumsp.JW043與散囊菌屬的其他幾個種明顯聚類在一簇；與曲霉屬、青霉屬、以及擬青霉屬明顯分布在兩個簇中(如圖3所示).在散囊菌屬的簇中，Eurotiumsp.JW043菌株和其他兩個冠突散囊菌Eurotiumcristatum strain EN220和Eurotiumcristatum strain UPM-A13具有非常高的同源性，其次與Eurotiumamstelodami(阿姆斯特丹散囊菌)和Eurotiumrubrum(赤散囊菌)組成一個較大的分支；該分支與外圍的Eurotiumrepens和Eurotiumherbariorum形成散囊菌屬類群.基于分子生物學的鑒定結(jié)果，菌株Eurotiumsp.JW043可確認為散囊菌屬微生物.

關于“金花菌”的分類鑒定，許多學者都進行過相關研究.早在1981年，倉道平等[10]認為茯茶中優(yōu)勢菌是灰綠曲霉群中的謝瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri).1990年，溫瓊英[11]通過電鏡觀察及培養(yǎng)特征，認為茯茶中優(yōu)勢菌株與英聯(lián)邦真菌研究所的冠突曲霉模式菌株172280的培養(yǎng)特征和顯微特征一致，因此將該菌確定為冠突曲霉.隨后溫瓊英和齊祖同對該菌作了進一步的研究，正式將該菌命名為冠突散囊菌[Eurotiumcristatum (Raper & Fennel 1) Malloch & Cain]，無性型名稱為針刺曲霉(Aspergillus spiculosus Blaster)，異名為冠突曲霉(Aspergillus cristatum Blaster)[12].本研究從陜西涇陽出產(chǎn)的茯茶中分離純化出一株“金花菌”，經(jīng)形態(tài)學觀察，其平板生長狀況(如圖2所示)與冠突散囊菌形態(tài)學具有較高的相似性.對分離菌株的ITS序列進行測序，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析及平板生長狀態(tài)，進一步確認其為散囊菌屬真菌.由于缺乏更多的證據(jù)證明其種水平、乃至亞種水平上的分類信息，因此將該菌株命名為Eurotiumsp.JW043.目前，采用真菌的轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)ITS序列進行分子水平的鑒定，具有速度快、指向性強、準確性高等優(yōu)點.ITS序列既具有一定的進化差異性，也具有特定區(qū)域的保守性，是用于真核生物鑒定、分類以及進化研究的重要分子標記之一.通過分子生物學鑒定微生物的分類信息目前已經(jīng)被眾多研究者廣泛應用[13-15].

圖3　菌株Eurotium sp.JW043的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2　培養(yǎng)基碳氮源篩選

固定碳源為葡萄糖，開展影響菌株Eurotiumsp.JW043產(chǎn)孢子和菌絲生長培養(yǎng)基氮源的單一因素篩選.結(jié)果表明，采用蛋白胨2 g/L培養(yǎng)時，菌株Eurotiumsp.JW043發(fā)酵液中產(chǎn)孢量最大，可達到9.84±1.16×107個/mL；以牛肉膏和酵母浸膏為氮源時，產(chǎn)孢量次之，分別可達到9.27±1.83×107個/mL和9.08±1.16×107個/mL(如圖4(a)所示).氮源對菌絲濕重的影響如圖4(b)所示，以硝酸銨為氮源的菌絲濕重量最大，可達到0.70±0.08 g；酵母作為氮源對菌株Eurotiumsp.JW043的菌絲生長量影響僅次于硝酸銨，其菌絲濕重量為0.46±0.056 g.綜合考慮對菌株Eurotiumsp.JW043的產(chǎn)孢量和菌絲濕重的影響，選取酵母浸膏用于后續(xù)正交試驗的氮源.

以酵母浸膏為氮源，對菌株Eurotiumsp.JW043生長的碳源進行篩選.分別采用20.0 g/L 的乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖作為碳源.其中20.0 g/L乳糖、蔗糖更能促進菌株Eurotiumsp.JW043孢子產(chǎn)生，分別達到1.21±0.13×108個/mL和1.11±0.14×108個/mL(如圖4(c)所示).蔗糖對菌絲濕重的影響較乳糖更為明顯，用蔗糖作為碳源，其濃度為20.0 g/L時，菌絲濕重可達到0.76±0.08 g；麥芽糖做碳源時，菌絲濕重達到最大，為0.85±0.08 g，然而其產(chǎn)孢數(shù)量最少(如圖4(d)所示).綜合考慮碳源對菌絲量、產(chǎn)孢量以及原料的成本等問題，選用蔗糖進行碳氮源的正交試驗.

菌株Eurotiumsp.JW043是一株制備茯茶發(fā)酵劑的潛在資源菌株，對于提高茯茶“發(fā)花”品質(zhì)、縮短茯茶發(fā)花周期具有重要的應用價值.因此，對于該菌株最適生長條件的探索顯得尤為重要.本研究首先采用單因素優(yōu)化的方法，篩選出蔗糖和酵母浸膏分別作為菌株發(fā)酵的碳源和氮源.已有研究證實，蔗糖是最利于菌絲生長的碳源之一[16，17]，與本研究碳源對菌絲生長影響的單因素實驗結(jié)果基本一致(如圖4(d)所示).

(a)不同氮源對產(chǎn)孢數(shù)量的影響

(b)不同氮源對菌絲濕重的影響

(c)不同碳源對產(chǎn)孢數(shù)量的影響

(d)不同碳源對菌絲濕重的影響圖4　菌株Eurotium sp.JW043碳氮源單因素優(yōu)化

2.3　碳氮源正交優(yōu)化培養(yǎng)基

實驗應用正交設計助手II v3.1.1(Orthogonality Experiment Assistant II v3.1.1)設計蔗糖、酵母浸膏以及硫酸鎂的3因素3水平正交試驗，探究最適合菌株Eurotiumsp.JW043產(chǎn)孢以及菌絲生長的培養(yǎng)基組成.在單因素實驗結(jié)果上，對培養(yǎng)基氮源和碳源濃度水平進行調(diào)整.如表1所示，對于菌株Eurotiumsp.JW043的產(chǎn)孢量，極差RA>RC>RB，即碳源蔗糖對產(chǎn)孢量的影響最大，其次是無機鹽硫酸鎂，最后為氮源酵母浸膏.根據(jù)各因素各水平對應結(jié)果的平均值，可以判斷最適合菌株孢子產(chǎn)生的培養(yǎng)基條件為A2B3C1，即每100 mL培養(yǎng)基中含有蔗糖5.0 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸鎂0.5 g和磷酸氫二鉀0.1 g.

表1　碳氮源對菌株Eurotium sp.JW043孢子產(chǎn)生正交條件設計及結(jié)果

如表2所示，碳源、氮源以及無機鹽硫酸鎂對于菌株Eurotiumsp.JW043菌絲濕重生長的影響程度不盡相同，極差RC>RA>RB，表明無機鹽硫酸鎂對菌絲濕重生長的影響最大，其次為碳源蔗糖，最后為氮源酵母浸膏.而根據(jù)各因素各水平對應結(jié)果的平均值，可以判斷最適合菌株Eurotiumsp.JW043菌絲濕重生長的培養(yǎng)基條件為A3B3C1，即每100 mL培養(yǎng)基中含有蔗糖7.5 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸鎂0.5 g和磷酸氫二鉀0.1 g.

表2　碳氮源對菌株Eurotium sp.JW043菌絲濕重生長的正交條件設計及結(jié)果

本研究中基于單因素培養(yǎng)實驗，進一步采用正交試驗方法，分別確定適合菌株Eurotiumsp.JW043菌絲生長以及產(chǎn)孢量提高的培養(yǎng)基成分組成.方差值R大小表明該因素對于產(chǎn)物的影響程度大小，并根據(jù)各水平產(chǎn)物含量平均值確定最適培養(yǎng)基組成.真菌的液體發(fā)酵過程中通常不產(chǎn)生或者只產(chǎn)生少量的孢子.本研究中液體發(fā)酵周期較長，發(fā)酵后期營養(yǎng)條件不足可能會導致孢子的產(chǎn)生.此外，已有木霉屬真菌產(chǎn)孢子的最適液體培養(yǎng)條件探索相關研究[18,19].碳源可以抑制孢子的產(chǎn)生[16]，而改變培養(yǎng)基碳氮比例在一定程度上可以促進孢子的產(chǎn)生.本研究中最適合孢子產(chǎn)生培養(yǎng)基的碳源與最適合菌絲生長的培養(yǎng)基碳源相比下降了30%，在一定程度上與前人研究結(jié)果一致.相對于無機氮源而言，有機氮更利于孢子的形成[20]，本研究中采用酵母浸膏作為產(chǎn)孢培養(yǎng)基的氮源，對于冠突散囊菌孢子的形成在一定程度上具有貢獻作用.

3　結(jié)論

本研究從陜西涇陽茯茶中分離出一株“金花菌”，結(jié)合形態(tài)學和分子生物學鑒定方法確定其為散囊菌屬真菌，命名為Eurotiumsp.JW043.并對其菌絲生長和產(chǎn)孢的培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化.通過單因素實驗篩選蔗糖和酵母浸膏分別為培養(yǎng)基碳源和氮源；通過正交試驗發(fā)現(xiàn)，適于該菌株孢子產(chǎn)生的培養(yǎng)基組成為100 mL培養(yǎng)基中含蔗糖5.0 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸鎂0.5 g和磷酸氫二鉀0.1 g；適于該菌株菌絲生長的培養(yǎng)基為100 mL培養(yǎng)基中含有蔗糖7.5 g、酵母浸膏1.5 g、硫酸鎂0.5 g和磷酸氫二鉀0.1 g.本研究對于進一步開發(fā)菌株Eurotiumsp.JW043為茯茶發(fā)酵劑，提高茯茶“發(fā)花”效率具有一定的應用價值.