王　婷， 張寒玉， 蔡長龍， 唐　朝， 毛培宏,，錢衛(wèi)東*， 李永東

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安　710021; 2.新疆大學(xué) 離子束生物技術(shù)中心, 新疆 烏魯木齊　830046; 3.西安工業(yè)大學(xué) 離子束生物工程與生物多樣性研究中心, 陜西 西安　710032； 4.寧波市疾病預(yù)防控制中心， 浙江 寧波　315010)

0　引言

酵母菌根據(jù)其合成乙醇能力的差異分為釀酒酵母和非釀酒酵母.大量研究表明一些非釀酒酵母對酒的品質(zhì)發(fā)揮積極作用，特別是產(chǎn)香氣型酵母，其賦予果酒濃郁的發(fā)酵香味，對果酒中醇類、酯類物質(zhì)的形成扮演著重要的角色.因此，近年來非釀酒酵母的釀酒作用、生物多樣性、分離鑒定及其潛在應(yīng)用價值研究已成為國內(nèi)外的研究熱點[1].前期本課題組從陜西洛川蘋果表面分離一株產(chǎn)香氣能力強的異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)，命名為Hansenulaanomala792.

異常漢遜酵母作為一種重要的非釀酒酵母，具有高產(chǎn)乙酸乙酯的能力，且在較高溫度的下具有較強的發(fā)酵力和酯化力.同時還具有一定的產(chǎn)酒精能力，并可以降低乙酸含量，提高丙三醇含量，提高有益香氣成分含量[1-5].目前，一些研究主要關(guān)注非釀酒酵母異常漢遜酵母的產(chǎn)香氣代謝能力研究，對其基因組的遺傳背景的研究報道相對較少.

重復(fù)序列是真核生物基因組中重要的組成部分，按其在基因組中的分布方式，分為串聯(lián)重復(fù)序列(Tandem Repeat Sequences)和散在重復(fù)序列(Interspersed Repeat Sequences)[6].串聯(lián)重復(fù)序列又可根據(jù)其重復(fù)單元長度劃分為衛(wèi)星DNA (Satellite DNA)[7]、小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)[8]和微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)[9].其中微衛(wèi)星DNA又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandom Repeat,STR)或簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats,SSRs)，隨機分布于生物體整個基因組中.微衛(wèi)星標記作為理想的分子遺傳標記，被廣泛地用于目的基因篩選、基因診斷多樣性分析及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等工作中.而散在重復(fù)序列(又稱轉(zhuǎn)座子元件，Transposable Element,TE)分為RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座元件(又稱 RNA轉(zhuǎn)座子)和DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座元件(又稱DNA 轉(zhuǎn)座子)，不僅可以影響基因組的大小，還能直接或間接促成基因組重排，并可影響基因表達水平、改寫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10].

本研究在異常漢遜酵母菌株792(Hansenulaanomala792)全基因組denovo測序的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法分析其基因組中各種重復(fù)序列的類型及分布特點，以期深入了解漢遜酵母菌株基因組結(jié)構(gòu)中重復(fù)序列的特征，為基于重復(fù)序列定向進化的分子育種及開發(fā)SSR分子標記提供理論依據(jù).

1　實驗部分

1.1　菌株及其全基因組De nove測序

菌株分離自陜西洛川蘋果表面，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)，分離純化，收集菌體，利用18S rDNA、28S rDNA和ITS(Internal Transcribed Spacer)的分子生物學(xué)方法鑒定為異常漢遜酵母，命名為異常漢遜酵母792，現(xiàn)保存于陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物制造研究室.異常漢遜酵母792菌株由北京諾禾致源生物信息科技有限公司微生物部制備基因組DNA，并應(yīng)用PacBio單分子測序技術(shù)對其進行全基因組Denove測序，所獲得的全基因組DNA序列，作為本研究的基本數(shù)據(jù).

1.2　基因組中重復(fù)序列的獲取

應(yīng)用TRF(Tandem Repeat Finder)方法 (http://tandem.bu.edu/trf/trf404.linux64.download.html)獲取異常漢遜酵母菌株792全基因組DNA序列中的串聯(lián)重復(fù)序列，最大的重復(fù)單元bp數(shù)設(shè)置為2 000 bp.

對TRF獲取的結(jié)果進行細分，設(shè)置微衛(wèi)星DNA序列重復(fù)單位為2～6 bp，小衛(wèi)星DNA序列重復(fù)單位為10～60 bp.

使用RepeatMasker 方法(http://www.repeatmasker.org/RMDownload.html)獲取異常漢遜酵母菌株792全基因組DNA序列中的散在重復(fù)序列.

2　結(jié)果與討論

2.1　微衛(wèi)星DNA序列在基因組中的分布特征

應(yīng)用TRF方法在異常漢遜酵母菌株792基因組中發(fā)現(xiàn)了175個SSR，總長分別為8 163 bp，占基因組DNA序列總長度的0.059%，平均每78.63 Kb就能檢測到一個SSR.

SSR在三核苷酸(Tri-)模體中的數(shù)目最多，為94條，占重復(fù)序列總數(shù)的53.71%；其次是六核苷酸(Hexa-)模體，為47條，占26.86%；五核苷酸(Penta-)和四核苷酸(Tetra-)模體數(shù)目相對較少，分別13～16條之間，占比約為7.43%～9.14%；二核苷酸(Di-)模體的重復(fù)序列最少，僅有3條，占1.71%.具體如圖1所示.

圖1　異常漢遜酵母菌株792基因組中不同模體類型的SSR分布

堿基類型的重復(fù)基序分析結(jié)果如表1所示.由表1可知，在4種兩堿基類型重復(fù)中，僅有AT重復(fù)基序.

三堿基類型重復(fù)基序有10種，其中數(shù)量較多的堿基類型依次是AAC(49條，52.13%)、ACT(15條，15.96%)、AAG(11條，11.70%).累積長度最長的依然是上述三個類型的重復(fù)序列：AAC(2011 bp)、ACT(744 bp)、AAG(545 bp).

四堿基類型重復(fù)序列中含有AAAT、AACT、ATTA、GAAT和GTTG重復(fù)類型，且前兩種類型數(shù)量較多，占四堿基重復(fù)序列數(shù)目的73.33%，長度較長，約占四核苷酸重復(fù)序列累積長度的74.05%.五堿基類型重復(fù)序列共有16條，其中AAAAC、TATAC和TGAAT重復(fù)單元的序列各有2條，共占五核苷酸重復(fù)的37.5%，其余各類型基序重復(fù)序列均只有1條.六堿基類型重復(fù)序列共46條，其每種重復(fù)單元基序數(shù)目均為1～2個.

表1　異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA的重復(fù)基序分布

續(xù)表1

重復(fù)類型重復(fù)序列數(shù)目占SSR總數(shù)的百分比/%累積長度/bp占SSR總長度百分比/%拷貝數(shù)范圍平　均拷貝數(shù)GATGAC10.57410.506.86.8GATGGT10.57510.628.58.5GGATCA10.57380.476.36.3GGTTCA10.57330.405.55.5GTGAAA10.571121.371919TATTAC10.57520.649.39.3TCATAA10.57330.405.55.5TCATCC10.57350.435.85.8TCATTT10.57290.364.84.8TCTTCA21.141201.478.3～11.29.75TCTTCC21.141301.5910～11.710.85TGAAGA21.141121.378.7～109.35TGAGGT21.14841.035.5～8.57TGATGG10.57350.435.85.8TGATGT10.57300.3755TGCTGT10.57320.395.35.3TTATGT10.57330.405.55.5TTCGTC10.57330.405.55.5TTCTGA21.14750.925.3～7.26.25TTCTTC10.571932.3632.232.2TTGCTG10.57270.334.54.5TTGTTT10.57340.425.75.7Subtotal4726.86239029.284.2～32.28.51

各種重復(fù)類型的拷貝數(shù)分析結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，微衛(wèi)星序列均在低拷貝區(qū)出現(xiàn)頻率較高，拷貝數(shù)低于15次的微衛(wèi)星序列占比75.43%；拷貝數(shù)在15～27之間的微衛(wèi)星序列，占比17.14%；拷貝數(shù)在27～39之間的占比6.86%；拷貝數(shù)大于39次的微衛(wèi)星序列最少，僅占0.57%.五種重復(fù)單位的平均拷貝數(shù)分別為33、15.04、12.76、7.33、8.51.從圖2可以看出，拷貝數(shù)越大，微衛(wèi)星序列數(shù)目越少，微衛(wèi)星平均拷貝數(shù)隨著重復(fù)單位長度的增加而減少.

表2　異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA不同模體的拷貝數(shù)分布

上述研究數(shù)據(jù)表明，重復(fù)序列是基因組的重要組成部分，對生物的進化、遺傳和基因的表達與調(diào)控有重要作用.重復(fù)序列是考察遺傳物質(zhì)在進化中無數(shù)次的重組及整合的活化石，其出現(xiàn)說明基因組中的遺傳物質(zhì)在不斷地進行自我復(fù)制，并進行水平交換和垂直交換，對豐富生物的遺傳信息具有重要作用[11].生物體中許多關(guān)鍵基因是單拷貝的，重復(fù)序列的存在能保護這些重要的基因結(jié)構(gòu)不受破壞，同時也是新基因產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，是驅(qū)動生物進化的重要因素之一[12].

圖2　異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA的重復(fù)單元長度與拷貝數(shù)關(guān)系

2.2　小衛(wèi)星DNA序列在基因組中的分布特征

利用TRF方法在異常漢遜酵母菌株792基因組的串聯(lián)重復(fù)序列中發(fā)現(xiàn)了1 384條小衛(wèi)星DNA序列，總長分別為79 849 bp，占串聯(lián)重復(fù)序列長度的33.80%，占基因組序列總長的0.58%，平均每10 Kb出現(xiàn)一個小衛(wèi)星序列.

小衛(wèi)星DNA的長度介于25 bp至958 bp之間，根據(jù)其序列長度可分為142種類型，長度為25～78 bp的序列數(shù)目占76.81%，30 bp的小衛(wèi)星序列最多，有80條，長度大于82 bp的序列各含一條.長度為15 bp的重復(fù)單位序列數(shù)目最多，有211條，占小衛(wèi)星序列總數(shù)的15.25%.重復(fù)單元為15 bp的序列累積長度最長，高達8 328 bp，占小衛(wèi)星序列總長的10.43%.各重復(fù)單元的拷貝數(shù)范圍為1.9～42.5，平均拷貝數(shù)為2.6的重復(fù)序列數(shù)目最多，有211條.小衛(wèi)星DNA序列的重復(fù)類型數(shù)目、序列長度及拷貝數(shù)見圖3所示.

圖3　異常漢遜酵母菌株792基因組小衛(wèi)星DNA序列的重復(fù)單元長度與其數(shù)量關(guān)系

小衛(wèi)星DNA序列數(shù)目與重復(fù)單位長度有一定關(guān)系，隨著重復(fù)單位長度的增加呈下降趨勢，這一特征在重復(fù)單元大于15 bp的小衛(wèi)星序列中尤為顯著；與微衛(wèi)星DNA類似，小衛(wèi)星DNA序列重復(fù)單位拷貝數(shù)較低，主要分布在1～3次；重復(fù)單元拷貝數(shù)與小衛(wèi)星DNA序列之間無顯著相關(guān)關(guān)系，見圖4所示.

圖4　異常漢遜酵母菌株792基因組小衛(wèi)星DNA序列的重復(fù)單元長度與其拷貝數(shù)關(guān)系

2.3　散在重復(fù)序列在基因組中的分布特征

運用RepeatMasker方法，獲得了異常漢遜酵母菌株792基因組中的多種散在重復(fù)序列(表3所示)，其在基因組中占比很小，僅為0.79%左右.其中長末端重復(fù)序列(LTR)數(shù)目最多，為695條，占總數(shù)的46.30%；其次是DNA轉(zhuǎn)座子，為459個；長散在重復(fù)序列(LINE)共303條；而短散在重復(fù)序列(SINE)只有25條；滾環(huán)(RC)14個.各類型散在重復(fù)的總長度分布與數(shù)目分布保持一致，其長度大小關(guān)系為LTR>DNA>LINE>SINE>RC，各占散在重復(fù)序列總長的48.54%、30.62%、23.42%、1.38%和1.27%.值得注意的是，雖然RC的重復(fù)序列數(shù)目較少，但其平均長度約為SINE的兩倍.

本研究所采用的RepeatMasker方法具有較高的效率和搜索速度，可以發(fā)現(xiàn)低拷貝數(shù)量的家族，但只能搜索同源序列，不能產(chǎn)生新的元素.這類方法被認為是黃金準則，通常作為查找重復(fù)序列的第一步.

表3　異常漢遜酵母菌株792基因組中散在重復(fù)序列的分布

3　結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)RepeatMasker方法分析了異常漢遜酵母菌株792全基因組中的重復(fù)序列在其基因組中的分布及特征.結(jié)果表明，重復(fù)序列在基因組中含量較少，為全基因組的2.52%；微衛(wèi)星DNA序列在其基因組中的占比不到千分之一，重復(fù)單元的拷貝數(shù)大多低于15個，重復(fù)單位長度與其拷貝數(shù)間存在著負相關(guān)；優(yōu)勢重復(fù)類型為三核苷酸重復(fù)，AAC為所有微衛(wèi)星DNA類型中數(shù)目最多的基序；兩核苷酸重復(fù)序列數(shù)目最少，且僅有AT重復(fù).

在微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA中，AT含量均大于50%.這與Edwards等人的研究結(jié)果一致，AT類型重復(fù)的在植物、酵母和真菌類串聯(lián)重復(fù)序列中的頻率最高[13].串聯(lián)重復(fù)串聯(lián)序列中富含AT，與其全基因組DNA序列中AT含量較高有關(guān)，異常漢遜酵母菌株792全基因組的AT含量高達65.47%，為串聯(lián)重復(fù)序列中富含AT提供了基礎(chǔ).對重復(fù)序列中的轉(zhuǎn)座元件的分析發(fā)現(xiàn)，RNA轉(zhuǎn)座子的數(shù)目與長度均高于DNA轉(zhuǎn)座子，這與其他酵母菌的研究結(jié)果一致[14].三核苷酸類型重復(fù)和六核苷酸類型重復(fù)是異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA序列的優(yōu)勢核苷酸類型.

異常漢遜酵母菌作為漢遜酵母屬中常見的一個種，具有一些釀酒酵母缺乏的釀造特性，是釀造產(chǎn)品香氣成分的主要貢獻者之一[15,16]，有助于最終產(chǎn)品感官特性的提高[17]，本研究結(jié)果為其分子育種和SSR分子標記的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，也為其遺傳多樣性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).