易建華， 寧建琴， 宋宏新， 郭　芮， 徐　丹， 吳丹丹， 衛(wèi)夢綺， 李亞俊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

0　引言

AFB1是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)毒菌株分泌的強(qiáng)致癌性真菌毒素，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)定為Ⅰ類致癌物[1].為保障公眾健康，食品安全相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)必須要對食品與飼料中AFB1含量進(jìn)行監(jiān)測與控制.目前AFB1常用的檢測方法有免疫分析法、儀器分析法，其中免疫分析法簡便、快速，但容易出現(xiàn)假陽性；而儀器分析法雖然準(zhǔn)確，但普通人較難掌握，因此急需開發(fā)一些簡便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測技術(shù).AFB1具有熒光性，可根據(jù)這一特性開發(fā)新型檢測方法，但AFB1在溶劑中易發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測靈敏度降低，只有增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度才能提高檢測靈敏度.研究發(fā)現(xiàn)AFB1、黃曲霉毒素Q1、姜黃素、阿霉素等弱極性化合物能進(jìn)入β-CD的空腔內(nèi)形成包合物.包合物的形成既增大了弱極性化合物的溶解性，又避免了溶劑對這些物質(zhì)的熒光猝滅作用，使其熒光性大大增強(qiáng)[2-10].因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究影響β-CD增強(qiáng)AFB1熒光強(qiáng)度的因素，并且通過Benesi-Hildebrand法、熱力學(xué)方法分析包合物的包合特性，為食品中AFB1高靈敏檢測方法的建立提供理論支持.

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

Costar 96微孔板,美國康寧公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品,美國sigma公司；β-CD(分析純),天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇均為分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司.

1.2　儀器與設(shè)備

Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE)，昆山市超聲儀器有限公司.

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同因素對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光強(qiáng)度的影響

(1)β-CD濃度對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光強(qiáng)度的影響

取40μL 500μg/L AFB1標(biāo)準(zhǔn)液于微孔板中，分別加入160μL濃度為2.0×10-2、1.5×10-2、1.25×10-2、1.0×10-2、5.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-3、5.0×10-4mol/L的β-CD溶液，混勻放置1 min，于激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm條件下測定AFB1熒光強(qiáng)度，并每隔10 min測定一次，分析包合物穩(wěn)定性，同時(shí)做只含AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)，每組平行3次.

(2)溫度對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光強(qiáng)度的影響

按章節(jié)1.3.1中(1)所述制備AFB1-β-CD包合物，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃下孵育5 min，于激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm條件下測定AFB1熒光強(qiáng)度，同時(shí)做只含AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)，每組平行3次.

(3)金屬離子對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光性的影響

取40μL 500μg/L AFB1標(biāo)準(zhǔn)液于微孔板中，分別加入160μL 含0.5×10-2mol/L HgCl2、NaCl、KCl、MgCl2、FeCl3、CaCl2的β-CD溶液(β-CD溶液濃度為1.0×10-2mol/L)，于激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm條件下測定AFB1熒光強(qiáng)度，同時(shí)做不加金屬離子的對照試驗(yàn)和只含AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)，每組平行3次.

(4)pH對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光性的影響

取40μL 500μg/L AFB1標(biāo)準(zhǔn)液于微孔板中，分別加入160μL pH為5、6、7、8的β-CD溶液(β-CD溶液濃度為1.0×10-2mol/L)，于激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm條件下測定AFB1熒光強(qiáng)度，同時(shí)做不調(diào)pH的對照試驗(yàn)和只含AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)，每組平行3次.

(5)脂肪醇對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光性的影響

取40μL 500μg/L AFB1標(biāo)準(zhǔn)液于微孔板中，分別加入80μL 甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇，然后每孔再加入80μL的β-CD溶液(β-CD溶液濃度為1.0×10-2mol/L)，于激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm條件下測定AFB1熒光強(qiáng)度，同時(shí)做不加脂肪醇的對照試驗(yàn)和只含AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)，每組平行3次.

(6)超聲時(shí)間對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光性的影響

將40μL 500μg/L AFB1標(biāo)準(zhǔn)液與160μL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液混合，分別超聲1 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min，于激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm條件下測定AFB1熒光強(qiáng)度，同時(shí)做不超聲的對照試驗(yàn)和只含AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)，每組平行3次.

1.3.2AFB1-β-CD包合物的特性研究[11]

(1)AFB1-β-CD包合物包合比及包合常數(shù)的測定

結(jié)合章節(jié)1.3.1中(1)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)改進(jìn)的Benesi-Hildebrand方程計(jì)算包合比和包合常數(shù)：

[AFB1]/(F-F0)=1/[β-CD]·K·α+1/α

(1)

式(1)中：F0和F分別為加入β-CD前后溶液的熒光強(qiáng)度；α為常數(shù)；[AFB1]和[β-CD]分別為AFB1和β-CD的總濃度；K是包合常數(shù).

(2)AFB1與β-CD包合反應(yīng)熱力學(xué)常數(shù)的測定

結(jié)合章節(jié)1.3.1中(2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)范德霍夫方程lnK=-ΔH/RT+ΔS/R，以各溫度條件下的lnK對溫度的倒數(shù)(1/T)進(jìn)行線性回歸，根據(jù)直線的斜率和截距可求得包合物形成過程中的熱力學(xué)參數(shù)：ΔH和ΔS；再根據(jù)熱力學(xué)定律:ΔH=ΔG+TΔS，可求得包合反應(yīng)的ΔG，R為氣體常數(shù)，約為8.314 J/(mol·K).

1.4　數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用OriginPro 8.0軟件進(jìn)行處理與分析.

2　結(jié)果與討論

2.1　β-CD濃度對AFB1熒光增強(qiáng)的影響

添加不同濃度β-CD后，AFB1熒光強(qiáng)度顯著增大，如圖1所示，隨著β-CD濃度的增加，AFB1熒光強(qiáng)度逐漸增大.AFB1在疏水作用、范德華力、氫鍵等非共價(jià)鍵的作用下，進(jìn)入β-CD的空腔中，避免了與溶劑分子的碰撞，降低了熒光的猝滅.當(dāng)β-CD濃度為1.0×10-2mol/L時(shí)AFB1熒光增強(qiáng)效果最明顯，增強(qiáng)倍數(shù)最大，達(dá)到5.99倍；而β-CD濃度大于1.0×10-2mol/L時(shí)，增強(qiáng)作用略有降低并趨于平衡，因此為達(dá)到最大的熒光增敏效果，應(yīng)將β-CD濃度調(diào)整為1.0×10-2mol/L.

圖1　不同濃度β-CD對AFB1熒光強(qiáng)度的影響

2.2　不同濃度β-CD下AFB1熒光增強(qiáng)作用穩(wěn)定性

AFB1與β-CD超分子體系熒光的穩(wěn)定性如圖2所示.雖然放置時(shí)間延長，但超分子體系的熒光強(qiáng)度基本未改變，這與前人研究結(jié)果一致，說明AFB1溶液中加入不同濃度的β-CD后，二者能夠快速反應(yīng)形成包合物，且所生成的包合物在長時(shí)間內(nèi)能保持穩(wěn)定；如張敏等[6,11]研究發(fā)現(xiàn)室溫條件下AFB1與β-CD混合搖勻放置1 min熒光強(qiáng)度即可穩(wěn)定，且長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定.

圖2　β-CD-AFB1包合物的穩(wěn)定性

2.3　不同溫度對AFB1-β-CD熒光強(qiáng)度的影響

溫度對包合反應(yīng)的影響如圖3所示.加入不同濃度的β-CD后，隨著溫度的逐漸升高，β-CD對AFB1熒光強(qiáng)度的增敏作用逐漸降低，數(shù)據(jù)顯示下降了16.4%～45.26%，說明室溫條件有利于包合反應(yīng)的進(jìn)行.張敏等[11]、馬良等[12]通過對β-CD與AFB1、AFG1包合反應(yīng)的熱力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)是一個(gè)放熱反應(yīng)，低溫利于包合物形成.因此為達(dá)到最大的熒光增敏效果，應(yīng)將包合溫度設(shè)定為20 ℃～25 ℃.

圖3　溫度對AFB1-β-CD包合物熒光強(qiáng)度的影響

2.4　不同金屬離子對AFB1-β-CD熒光增強(qiáng)效應(yīng)的影響

金屬離子在不同程度上會影響β-CD增強(qiáng)AFB1熒光強(qiáng)度的效果，如圖4所示.Fe3+、Mg2+、K+、Na+、Ca2+減弱了熒光增強(qiáng)的作用，其中以Fe3+的減弱作用最大；而Hg2+對β-CD增敏AFB1熒光有協(xié)同作用，顯著增強(qiáng)AFB1的熒光強(qiáng)度，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Hg2+使AFB1的熒光光譜略紅移，而其他金屬離子基本未改變AFB1的熒光光譜.張敏等[6]發(fā)現(xiàn)Hg2+能夠與AFB1形成金屬螯合物，明顯提高AFB1的熒光強(qiáng)度，分析可能是由于Hg屬于過渡金屬元素，易形成配位數(shù)為6的配合物，其幾何構(gòu)型通常是相當(dāng)于6個(gè)配位原子占據(jù)八面體或變形八面體的角頂，增強(qiáng)了AFB1-Hg2+共軛平面，加大了剛性結(jié)構(gòu).因此為提高β-CD對AFB1熒光性的增強(qiáng)作用，應(yīng)向反應(yīng)體系添加Hg2+.

圖4　不同金屬離子對AFB1-β-CD體系熒光強(qiáng)度影響

2.5　pH對AFB1-β-CD熒光增強(qiáng)效應(yīng)的影響

pH對AFB1-β-CD熒光增強(qiáng)效應(yīng)的影響如圖5所示.將超分子反應(yīng)體系pH調(diào)整到5～8時(shí)，能增強(qiáng)β-CD對AFB1熒光增敏效果，使增強(qiáng)效果從6.58倍增加到7.83～8.17倍.這可能是由于用不同pH磷酸鹽緩沖液配制AFB1和β-CD溶液，使得包合物體系中的離子強(qiáng)度增加，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)效果略有增加.因此為達(dá)到最大的熒光增敏效果，應(yīng)將反應(yīng)體系pH調(diào)整為6.

圖5　pH對AFB1-β-CD體系熒光強(qiáng)度影響

2.6　脂肪醇對AFB1-β-CD熒光增強(qiáng)效應(yīng)的影響

超分子反應(yīng)體系中加入脂肪醇后，會改變體系的微環(huán)境，影響β-CD對AFB1的熒光增敏效果.如圖6所示，甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇對β-CD增強(qiáng)AFB1熒光強(qiáng)度的效果有促進(jìn)作用，但正丁醇有減弱作用.在脂肪醇存在下，AFB1熒光光譜藍(lán)移，說明電子躍遷的能量增大，醇羥基能與環(huán)糊精端口形成氫鍵而減小其微環(huán)境的極性，使AFB1更容易進(jìn)入環(huán)糊精腔中，醇分子的烷基鏈越長,形成氫鍵能力越大，使空腔微極性減小得越多，但由于正丁醇的空間位阻較大，使AFB1不能全部進(jìn)入環(huán)糊精腔中，就已經(jīng)封口，所以正丁醇具有減弱熒光增強(qiáng)效果的作用[13].因此為達(dá)到最大的熒光增敏效果，應(yīng)向反應(yīng)體系添加異丙醇，改變體系微環(huán)境.

圖6　醇類物質(zhì)對AFB1-β-CD體系熒光強(qiáng)度影響

2.7　超聲對AFB1-β-CD熒光增強(qiáng)效應(yīng)的影響

超聲對AFB1-β-CD熒光增強(qiáng)效應(yīng)的影響如圖7所示.短時(shí)超聲未影響β-CD對AFB1熒光強(qiáng)度的增敏作用，但隨著超聲時(shí)間的延長，體系的溫度會逐漸上升，而溫度升高不利于包合反應(yīng)的進(jìn)行，使β-CD對AFB1熒光增敏作用降低.

圖7　超聲對AFB1-β-CD體系熒光強(qiáng)度影響

2.8　AFB1-β-CD包合物的特性研究

根據(jù)改進(jìn)的Benesi-Hildebrand方程計(jì)算包合比和包合常數(shù)，如圖8所示.[AFB1]/(F-F0)對1/[β-CD]雙倒數(shù)圖呈線性關(guān)系，說明AFB1與β-CD只形成了1∶1包合；由雙倒數(shù)圖計(jì)算得到包合常數(shù),如表1所示.

圖8　AFB1-β-CD雙倒數(shù)圖

溫度/K包合常數(shù)/(L/mol)ΔG/(kJ/mol)ΔH/(kJ/mol)ΔS/(kJ/mol)298.5303.7308.9314.13.68×1071.27×1076.95×1066.40×106-42.38-41.83-41.28-40.73-74.03-0.11

由表1可知，ΔS=-0.11 kJ/mol，ΔH=-74.03 kJ/mol，ΔG為-42.38 kJ/mol到-40.73 kJ/mol，且隨著溫度的升高，K值逐漸減小，說明包合物可能趨于離解，客體分子又從β-CD空腔內(nèi)重新進(jìn)入水相，包合物的穩(wěn)定性降低.在本體系中，ΔG<0說明包合過程是一個(gè)自發(fā)的過程，ΔH<0說明反應(yīng)是一個(gè)放熱過程，ΔS<0說明分子幾何形狀引起的空間障礙，以及空腔對客體分子平移和旋轉(zhuǎn)自由度的限制在包合過程中起著非常重要的作用[14]；Amadasi等[15]利用計(jì)算氫鍵互做的HINT程序分析AFB1與β-CD的包合模型為：AFB1的部分呋喃環(huán)進(jìn)入了腔體，芳香環(huán)伸向溶劑并靠近腔體邊緣，使得AFB1的羧基與β-CD羥基形成氫鍵.

3　結(jié)論

β-CD對AFB1熒光增強(qiáng)作用受到很多因素的影響，其中β-CD濃度、溫度、金屬離子、脂肪醇和pH能顯著影響AFB1-β-CD的熒光強(qiáng)度，而超聲對該體系熒光強(qiáng)度影響不大，具體表現(xiàn)為：隨著β-CD濃度增加，體系熒光強(qiáng)度逐漸增大然后略減小并保持恒定；隨著溫度升高，β-CD對AFB1熒光的增強(qiáng)作用逐漸減弱；Hg2+能提高體系熒光強(qiáng)度，而Fe3+、Mg2+、K+、Na+、Ca2+能減弱體系熒光強(qiáng)度；弱酸性條件和異丙醇的添加能顯著增強(qiáng)體系熒光強(qiáng)度.β-CD對AFB1熒光增強(qiáng)的最佳條件：β-CD濃度為0.01 mol/L，異丙醇濃度為50 %(v/v)，HgCl2濃度為0.5×10-2mol/L，反應(yīng)體系pH為6，包合溫度為25 ℃.AFB1與β-CD包合比為1∶1，包合常數(shù)K=3.68×107L/mol，包合過程的熵變ΔS=-0.11 kJ/mol、焓變ΔH=-74.03 kJ/mol及自由能變化ΔG=-42.38 kJ/mol，說明包合反應(yīng)是放熱反應(yīng)且能自發(fā)進(jìn)行，焓變是形成超分子包絡(luò)物的主要驅(qū)動(dòng)力.