史崇麗，繆錦來,3

( 1.青島科技大學(xué)，山東 青島266000； 2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266000； 3.青島大學(xué)，山東 青島266000 )

南極地區(qū)自然環(huán)境惡劣，使得動植物難以生存，因此對于南極地區(qū)的生物研究以微生物為主。南極真菌在生物物種、活性代謝產(chǎn)物等方面表現(xiàn)出明顯的多樣性和新穎性，據(jù)不完全統(tǒng)計，在南極大陸已發(fā)現(xiàn)的約251種真菌中，有至少20種為新種(約占8%)，顯示了南極真菌的新穎性和多樣性[1]。且南極真菌的次級代謝產(chǎn)物具有非常高的催化活性，成為醫(yī)藥研究新的重要資源[2-5]。本研究對實驗室保存的一株南極絲狀真菌，通過生態(tài)觀察、分子水平檢測、分析其rDNA序列確定了該真菌與出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)的相似度最高，為再進一步深入研究該菌種的特性及應(yīng)用提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

采自南極的真菌AS，由國家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[6]：培養(yǎng)基葡萄糖(8 g/L)， MgSO4(1 g/L)， K2HPO4(1 g/L)，酵母膏(2 g/L)，測得pH為6.86。斜面培養(yǎng)基：瓊脂(20 g/L)，其他成分同種子培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑

RNase(Sigma)10 mg/mL；異丙醇；70%乙醇；無水乙醇；10% SDS；1X TAE(pH 8.0)；純化水(經(jīng)Millipore 過濾滅菌)。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R離心機(Eppendorf公司)；純水儀(德國默克密理博公司)；電泳儀DYY-7B(北京六一儀器廠)；凝膠成像分析儀JY04S-3E(君意電泳)；PCR儀(Thermo ARKTIK)；紫外分光光度計(島津)；電子顯微鏡ELWD 0.3/OD75(Nikon)；恒溫?fù)u床ZQLY-180S(上海知楚儀器有限公司)；研缽；酒精燈。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株形態(tài)觀察

將保存的菌種采用劃線法或點接種法，進行菌株活化培養(yǎng)，在固體培養(yǎng)基上觀察菌株形態(tài)，在顯微鏡下觀察液體培養(yǎng)基的菌株形態(tài)。

1.3.2 提取基因組DNA

在酒精燈火焰旁取培養(yǎng)基上的菌株于研缽，液氮研磨[7]；將研磨好的菌株轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，標(biāo)記菌株名稱，加入 0.6 mL TE(pH 8.0)，用槍頭吸打均勻，使菌體充分懸??；加入 250 μL 10% SDS，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻。加入 3 μL 蛋白酶 K(20 ng/μL)，輕輕混勻，37 ℃水浴 1 h。加入 150 μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻；加入 150 μL 2% CTAB，輕輕混勻，65 ℃水浴 20 min。12 000 r/min 常溫離心 20 min；小心吸取上清液至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置 30 min，12 000 r/min，4 ℃離心 10 min。吸掉上清液，在吸水紙上控干液體，加 750 μL 70%乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復(fù)顛倒數(shù)次，12 000 r/min，4 ℃離心 2 min；每管加入 30 μL 純化水溶解沉淀(水中加 RNase，終質(zhì)量濃度 10 ng/μL)，用手輕彈管壁，4 ℃溶解過夜。

1.3.3 DNA電泳檢測

電泳條件：采用1×TAE電泳緩沖液，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板純度。加樣量為5 μL，電泳儀電壓為120 V，電泳時間為30 min。紫外燈下檢測菌株基因組DNA提取情況?；蚪MDNA Marker 條帶組成:1000、2000、3000、4000、5000、6000、8000、10 000 bp。4000 bp 條帶質(zhì)量濃度為 20 ng/μL，顯示為加亮帶，其余條帶質(zhì)量濃度均為 10 ng/μL。PCR擴增產(chǎn)物Marker 條帶組成：100、250、500、750、1000、2000、3000、5000 bp。750 bp 條帶質(zhì)量濃度為 20 ng/μL，顯示為加亮帶，其余條帶質(zhì)量濃度均為 10 ng/μL。

1.3.4 ITS rDNA的PCR擴增

采用18S引物序列，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[8]，對菌株進行ITS序列擴增。30 μL反應(yīng)體系如下：H2O 17.8 μL，Buffer 3 μL，dNTP 2 μL，PrimerⅠ3 μL，PrimerⅡ3 μL，DNA模板 1 μL，酶 0.2 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min ，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 ITS rDNA序列測定及分析

由北京六合華大基因科技有限公司完成純化和測序工作。將測序結(jié)果登錄GenBank進行BLAST比對，選出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。采用Clustal W軟件進行多序列比對分析。使用Mega 6.0軟件采用最大似然法[9]計算，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，采用自舉分析進行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

1.4 菌株優(yōu)化培養(yǎng)

1.4.1 溫度篩選

將200 mL培養(yǎng)基裝于500 mL錐形瓶中，26 ℃培養(yǎng)24 h，作為菌株母種。在含有87 mL的種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接種15%的菌液，并設(shè)置溫度為15、25、30 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床，將接種后的培養(yǎng)基置于不同溫度的搖床中培養(yǎng)，每隔一段時間，在600 nm處測量不同溫度下的吸光值(記作OD600)，OD600作為反映菌株生長密度的指標(biāo)之一。繪制不同溫度下菌株的生長曲線。

1.4.2 無機鹽離子篩選

將200 mL培養(yǎng)基裝于500 mL錐形瓶中，26 ℃培養(yǎng)24 h，作為菌株母種。在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的種子培養(yǎng)基，另分別加入5 g/L的氯化鎂、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈣、氯化鐵、氯化錳及硫酸鋅離子，經(jīng)高溫高壓滅菌后，接入菌種20%，將錐形瓶放在已經(jīng)篩選的適宜溫度的搖床中培養(yǎng)，觀察菌液生長狀態(tài)，并每隔一段時間測量其OD600。

1.4.3 pH篩選

將200 mL培養(yǎng)基裝于500 mL錐形瓶中，在30 ℃，150 r/min中培養(yǎng)12 h，作為菌株母菌種。用pH計測量種子培養(yǎng)基的自然pH為6.86，設(shè)定pH分別為5、6、7、8、9的種子培養(yǎng)基，在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的種子培養(yǎng)基，接菌量為20%，在30 ℃的搖床中培養(yǎng)，每隔一段時間，在600 nm處測量不同培養(yǎng)基的吸光值，繪制不同初始pH條件下的菌株生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 菌株AS形態(tài)鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株在液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)

將液體培養(yǎng)基中的菌液混勻，用一次性滴管將菌液涂在載玻片上，在顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖1。可見菌株多為球型或卵圓形單個存在，直徑約2 μm，或幾個細(xì)胞連接在一起，如串珠狀，多為出芽生殖。

2.1.2 菌株在固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)

在斜面培養(yǎng)基室溫(約25 ℃，下同)條件下中約12 h便可生長出橘黃色小菌落(圖2a)；圖2b為劃線接種，室溫培養(yǎng)約24 h，并4 ℃冰箱保存一個月的菌株AS。在固體培養(yǎng)基的生長初期，菌落呈中央凸起、濕潤、黏稠、可流動的黏液狀，生長中后期，菌株室溫培養(yǎng)一周后可觀察到菌落周邊帶有毛邊，有些出現(xiàn)菌絲黏連的現(xiàn)象。

圖1 菌株液體培養(yǎng)顯微形態(tài)

圖2 菌株在固體培養(yǎng)基的生長狀態(tài)

2.2 菌株AS分子鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株AS ITS序列擴增結(jié)果

由圖3可見，菌株ITS序列擴增產(chǎn)物在約500 bp的位置有清晰條帶，且無其他雜質(zhì)存在。

圖3 基因組DNA及PCR擴增產(chǎn)物圖片

2.2.2 同源性分析結(jié)果

選擇與菌株AS同源性較高的菌株的ITS序列進行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)，由系統(tǒng)進化樹可知，菌株AS與出芽短梗霉菌同源性最高，同時結(jié)合菌株AS的形態(tài)觀察，可初步鑒定菌株AS為出芽短梗霉菌。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 菌株培養(yǎng)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)溫度對出芽短梗霉菌AS生長的影響

出芽短梗霉菌AS在不同溫度下的生長曲線見圖5。當(dāng)菌株處于對數(shù)生長期時，培養(yǎng)溫度越高，菌株生長的越快；當(dāng)菌株處于穩(wěn)定期時，30 ℃時，菌液密度最高，其次是25 ℃，15 ℃時的菌液密度最低。

圖5 出芽短梗霉菌AS在不同培養(yǎng)溫度下的生長曲線

2.3.2 不同無機鹽離子對出芽短梗霉菌AS的影響

培養(yǎng)約17 h后，出芽短梗霉菌AS處于穩(wěn)定生長期，此時添加CaCl2的培養(yǎng)基OD600值最大，添加ZnSO4的培養(yǎng)基OD600值基本無變化，出芽短梗霉菌AS培養(yǎng)狀態(tài)見表1。

表1 不同無機鹽離子對菌株生長的影響

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH對出芽短梗霉菌AS的影響

出芽短梗霉菌AS在不同pH條件下的的生長曲線見圖7。可以看出該菌株在弱酸性和弱堿性的條件下對數(shù)生長期和穩(wěn)定期生長趨勢相同，具有較好的適應(yīng)性。

圖6 出芽短梗霉菌比在不同初始pH下的生長曲線

3 討 論

3.1 菌株鑒定定結(jié)果分析

本試驗以南極真菌AS為研究對象，利用傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)方法[6-8]對菌株AS進行鑒定，經(jīng)菌株生長觀察可以看出，菌株AS具有多形態(tài)細(xì)胞，如酵母狀細(xì)胞、梗狀菌絲體細(xì)胞[9]。經(jīng)分子生物學(xué)分析結(jié)果初步確定，真菌AS為出芽短梗霉菌。

短梗霉，在分類學(xué)上屬于短梗霉屬，在酵母菌分類中屬于酵母菌的一個屬，是多細(xì)胞形態(tài)的類酵母真菌[10]。其生存能力極強，適應(yīng)自然環(huán)境的各個角落，如淡水、海水、森林生態(tài)系統(tǒng)、動植物組織等，并多棲息于多種極端環(huán)境[11]。短梗霉具有種類的多樣性，研究者將短梗霉分為3個種，包括5個變種[12]。目前已有對短梗霉菌的生長條件、代謝產(chǎn)物的研究[9,13-14]。

3.2 出芽短梗霉菌AS生長特性分析

采用單因素試驗對出芽短梗霉菌AS的生長條件進行優(yōu)化，設(shè)定15、25、30 ℃ 3個不同溫度，通過控制試驗變量，測量隨溫度和時間的改變，菌液密度的變化，初步確定，溫度為30 ℃時出芽短梗霉菌AS生長速度較快。試驗在選定適宜生長溫度的基礎(chǔ)上，經(jīng)多次測量OD600發(fā)現(xiàn)，出芽短梗霉菌AS生長約17 h，吸光值不再改變，說明此時的出芽短梗霉菌AS生長處于穩(wěn)定期；此時添加Mg2+和Ca2+的菌液在600 nm處的吸光值明顯高于其他無機鹽離子，說明這兩種無機鹽離子較其他無機鹽離子而言，更有利于出芽短梗霉菌AS生長；通過觀察在不同無機鹽中的出芽短梗霉菌AS生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基澄清或產(chǎn)生沉淀，均不利于出芽短梗霉菌AS生長。 對出芽短梗霉菌AS生長最適pH進行探究，試驗表明pH 5～9時，菌種的生長狀態(tài)無太大差異，表明出芽短梗霉菌AS對不同pH的適應(yīng)性較強。

本研究主要對一株生命力極強的南極真菌進行鑒定，并初步探究了其生長條件，以期在為合成與生存環(huán)境相關(guān)的功能性生物分子如表面活性劑、普魯蘭多糖、海藻糖、納米顆粒、及其他生物活性物質(zhì)等奠定基礎(chǔ)。王帥等[15]對本實驗室保存的一株南極酵母進行培養(yǎng)，并對海藻糖的提取工藝進行優(yōu)化；周鮮嬌等[16]對一株海洋紅酵母(Rhodotorula)進行鑒定并對其培養(yǎng)基做了優(yōu)化處理；安鑫龍等[17]對海洋微生物在海洋污染治理中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行了分析；這些試驗均說明了在極端海洋環(huán)境下生存的微生物，具有極強的生命力，且具有廣闊的應(yīng)用前景[18]。