張 鳳，韓利文，張 云，韓 建，侯海榮，王希敏，劉可春，田青平，何秋霞

[1. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014]

氯氮平是一種非典型抗精神病藥物，對(duì)于精神分裂癥患者具有明顯的療效，并且減少了導(dǎo)致錐體外系運(yùn)動(dòng)障礙的傾向。自1961年上市以來(lái)，因?yàn)楦弊饔茫鹊揭恢憋柺軤?zhēng)議。氯氮平毒性機(jī)制研究的結(jié)論不一致。最初報(bào)道的副作用是粒細(xì)胞缺乏癥，最近幾年集中在心臟毒性。氯氮平引起的心臟毒性報(bào)道最多的是心肌炎[1]，擴(kuò)張型心肌病和心包炎也有報(bào)道。嚴(yán)重的心臟副作用不僅影響了氯氮平對(duì)患者的治療效果，還限制了其廣泛應(yīng)用。臨床數(shù)據(jù)顯示，受感染患者的心內(nèi)膜心肌活檢標(biāo)本中可以觀察到嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性包涵體。因此，很多研究認(rèn)為，IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)是氯氮平心臟毒性的原因。此外，Elman等[2]發(fā)現(xiàn)，相比其他抗精神病藥物，氯氮平治療患者血漿的去甲腎上腺素水平升高，這可致左心室功能障礙。其他可能的氯氮平心臟毒性機(jī)制包括細(xì)胞色素P450 1A2、1A3酶缺乏，鈣依賴性離子通道的阻斷，以及低硒水平[3]。探索其心臟毒性發(fā)生的機(jī)制既有利于解釋氯氮平產(chǎn)生心肌炎、心包炎的原因，又可為進(jìn)一步尋找保護(hù)心臟損傷的藥物提供參考。

斑馬魚(yú)是近年來(lái)廣受關(guān)注的整體模式生物，其基因組編碼序列與人類基因組的同源性為87%左右。斑馬魚(yú)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動(dòng)物高度相似，具有繁殖能力強(qiáng)、體積小、成本低、發(fā)育周期短、胚胎透明、體外發(fā)育等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物活性篩選[4]、模型構(gòu)建和毒理學(xué)[5]評(píng)價(jià)中。發(fā)育早期的斑馬魚(yú)胚胎透明，研究人員可以清晰地觀察到斑馬魚(yú)的心跳以及血液循環(huán)，直觀評(píng)估其心率、收縮性、節(jié)律性和形態(tài)變化[6]。因此，本研究采用斑馬魚(yú)作為模式生物，旨在揭示氯氮平心臟毒性的反應(yīng)和發(fā)生機(jī)制，為氯氮平臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器氯氮平(批號(hào)076M4128V)、吖啶橙(acridine orange，AO，批號(hào)A6014)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser cDNA合成試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；SYBR? Green PCR Master Mix熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Vazyme公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。HPG-280BX型光照培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；斑馬魚(yú)養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備(北京愛(ài)生科技公司)；奧林巴斯SZX16型熒光體視顯微鏡、IX51奧林巴斯倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；LightCycler? 96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型AB系斑馬魚(yú)，由山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，養(yǎng)殖和繁殖方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]。將斑馬魚(yú)放在水溫為28℃的魚(yú)缸中飼養(yǎng)，光照周期為14 h光照和10 h黑暗。成魚(yú)的食物為鹵蟲(chóng)的無(wú)節(jié)幼體，每天喂食兩次。日常飼養(yǎng)過(guò)程中，♀♂斑馬魚(yú)分開(kāi)喂養(yǎng)，在需要收集胚胎時(shí)將♀♂斑馬魚(yú)按照1 ∶2 或1 ∶1的比例放入交配缸中。于次日早上抽去隔板，利用光照刺激交配反射，抽去隔板1～2 h后，收集受精卵，并用胚胎培養(yǎng)水(5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.14 mmol·L-1CaCl2、0.16 mmol·L-1MgSO4)清洗3遍，除去斑馬魚(yú)排泄物和死卵，健康胚胎放入28.5℃恒溫光照培養(yǎng)箱(HPG-280BX型)中繼續(xù)孵育，在受精24 h后于顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎，備用。

1.3方法

1.3.1氯氮平的急性毒性檢測(cè) 將發(fā)育正常的24 hpf斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)地吸到6孔培養(yǎng)板中，每孔30個(gè)，加入不同濃度的氯氮平工作液(12.5、25、37.5、50、62.5、75、80、100 μmol·L-1)，同時(shí)設(shè)置0.1% DMSO的溶劑對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在48、72、96 hpf時(shí)分別于倒置熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)的心率、心包水腫情況，并在SZX16型體式熒光顯微鏡下對(duì)各組進(jìn)行形態(tài)學(xué)拍照。

1.3.2細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用AO染色試劑檢測(cè)氯氮平誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。AO是一種熒光色素染料，能透過(guò)細(xì)胞膜。正常細(xì)胞染色后呈現(xiàn)均一的綠色，凋亡細(xì)胞則呈現(xiàn)致密或顆粒狀的黃綠色[8]。隨機(jī)選擇15條72 hpf和96 hpf斑馬魚(yú)胚胎，加入終濃度為25 mg·L-1的AO溶液，于28℃培養(yǎng)箱中孵育50 min，后用PBS沖洗3遍，在體式熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照，利用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)心臟部位陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.3RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR 分別在氯氮平處理24、48、72 h時(shí)收集魚(yú)卵樣本，按照納米磁珠法RNA提取試劑盒說(shuō)明書抽提各處理組的總RNA，對(duì)與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行分析，包括抑制凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax、caspase家族(caspase-3和caspase-9)。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，取1 μg RNA合成cDNA，并進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，引物序列見(jiàn)Tab 1。以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

Tab 1 Primers used in real-time PCR

2 結(jié)果

2.1氯氮平對(duì)斑馬魚(yú)胚胎死亡率及形態(tài)學(xué)的作用如Fig 1A所示，氯氮平處理72 h后，隨著藥物濃度的增加，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的死亡率逐漸增加；62.5 μmol·L-1的氯氮平導(dǎo)致斑馬魚(yú)全部死亡。氯氮平處理72 h的LC50值約為50 μmol·L-1。形態(tài)學(xué)檢測(cè)表明，氯氮平可劑量依賴地誘導(dǎo)斑馬魚(yú)出現(xiàn)體長(zhǎng)縮短(Fig 1B)、心包水腫(Fig 1C)等毒性表型。氯氮平處理48 h后，37.5 μmol·L-1及以上濃度的斑馬魚(yú)胚胎體長(zhǎng)明顯縮短，與溶劑對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。

2.2氯氮平導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎心率降低如Fig 2所示，經(jīng)氯氮平處理24、48、72 h后，暴露于25 μmol·L-1及以上濃度的斑馬魚(yú)胚胎的心率明顯降低。在72 h時(shí)，暴露于50 μmol·L-1濃度氯氮平的斑馬魚(yú)每分鐘心率值為對(duì)照組的25%。

2.3氯氮平誘導(dǎo)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞凋亡AO染色的結(jié)果如Fig 3所示，對(duì)照組的斑馬魚(yú)心臟部位沒(méi)有細(xì)胞發(fā)生凋亡，但暴露于37.5、50、62.5 μmol·L-1的氯氮平后，胚胎心肌細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多現(xiàn)象具有劑量依賴性。

2.4氯氮平對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響氯氮平處理斑馬魚(yú)胚胎24、48、72 h后分別收集胚胎，提取總mRNA，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。如Fig 4、Tab 2所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)氯氮平處理24 h后，胚胎細(xì)胞Bcl-2與Bax表達(dá)比值不變；處理48 h后，各組細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)水平均升高，但Bcl-2與Bax的比值不變；72 h后，各組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，氯氮平(37.5、50 μmol·L-1)處理組細(xì)胞Bax表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低。此外，藥物處理48 h后，caspase-3和caspase-9的表達(dá)水平明顯上調(diào)；72 h后，caspase-9表達(dá)水平仍然升高，而caspase-3逐漸恢復(fù)正常。

Tab 2 Effects of clozapine on the mRNAexpression ratio of Bcl-2 and Bax

**P<0.01vscontrol

Fig 1 The mortality and morphologic response of zebrafish embryo to clozapine treatment

Fig 2 Effect of clozapine on heart rate of

**P<0.01vscontrol

3 討論

氯氮平是20世紀(jì)60年代末出現(xiàn)的第一種非典型抗精神病藥物，其對(duì)大腦內(nèi)5-羥色胺受體和多巴胺受體具有較強(qiáng)的阻滯作用，能緩解患者的幻覺(jué)、妄想、興奮躁動(dòng)等癥狀，尤其對(duì)難治性精神分裂癥具有獨(dú)特療效[8]。有文獻(xiàn)表明，精神病患者在治療期間長(zhǎng)期服用氯氮平會(huì)引起心肌酶水平的變化，其中以肌酸激酶(creatine kinase，CK)升高最為明顯[9]。CK相比其他酶對(duì)心肌缺血和心內(nèi)膜下心肌梗死的診斷更靈敏，急性心梗時(shí)，血清CK活力明顯升高。臨床病例報(bào)道，患者服用氯氮平第3周后，出現(xiàn)心包、胸膜的滲出性反應(yīng)，停藥后該不良反應(yīng)消失，排除其他感染性原因后，考慮可能是由患者的個(gè)體敏感性引起的，故在臨床應(yīng)用氯氮平時(shí)應(yīng)慎重[10]。

斑馬魚(yú)的心臟是第一個(gè)發(fā)育和發(fā)揮功能的器官，于22 h開(kāi)始跳動(dòng)，48 h心血管基本結(jié)構(gòu)形成，并表現(xiàn)出一系列復(fù)雜的離子通道和代謝過(guò)程。斑馬魚(yú)胚胎透明，可以在活體上直接觀察其心臟的形狀、大小，并可記錄心率，在心血管毒性評(píng)價(jià)研究方面優(yōu)勢(shì)明顯[11]。利用斑馬魚(yú)胚胎，研究人員對(duì)阿司咪唑的心臟毒性進(jìn)行了研究，揭示了其潛在的心臟毒性副作用，證明了斑馬魚(yú)是一種有效、可靠的可快速檢測(cè)化合物心臟毒性的模式生物[12]。心率變化是評(píng)價(jià)心臟毒性的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯氮平處理后，斑馬魚(yú)胚胎心臟功能受損，心率下降明顯，而且出現(xiàn)嚴(yán)重的心包水腫，體長(zhǎng)縮短的畸形變化，這與文獻(xiàn)中抗精神病藥物引起心臟毒性的結(jié)果一致[13]。

AO染色實(shí)驗(yàn)證明，氯氮平誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)心臟細(xì)胞凋亡。定量PCR結(jié)果也表明，給藥72 h后，斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值明顯下降。Bcl-2和Bax都屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2具有抑制心肌細(xì)胞凋亡作用，Bax具有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡作用。當(dāng)發(fā)生凋亡時(shí)，Bcl-2/Bax比值會(huì)下降，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放，進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中caspase-9的表達(dá)也出現(xiàn)升高趨勢(shì)，而caspase-3表達(dá)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這可能與體內(nèi)存在的代謝補(bǔ)償機(jī)制有關(guān)。以上結(jié)果表明，氯氮平是通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族基因表達(dá)，激活caspase-3和caspase-9基因表達(dá)上調(diào)而誘導(dǎo)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞凋亡。氯氮平誘導(dǎo)斑馬魚(yú)細(xì)胞凋亡致心臟毒性的結(jié)果與已有報(bào)道一致。據(jù)報(bào)道，氯氮平處理后的鼠血清CK同工酶和乳酸脫氫酶水平會(huì)明顯升高，同時(shí)TNF-α、MDA、NO、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷、caspase-3、NF-κB的釋放量也是增加的，這說(shuō)明氧化應(yīng)激、基因損傷和凋亡機(jī)制參與到了氯氮平產(chǎn)生心臟毒性的過(guò)程[14]。接下來(lái)，我們將開(kāi)展氯氮平導(dǎo)致斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激方面的研究。

Fig 3 Effect of clozapine on apoptosis of cardiomyocyte cell in n=15)

Fig 4 Effect of clozapine on the mRNA expression of apoptosis-related n=5 )

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用斑馬魚(yú)模式生物對(duì)氯氮平的不良反應(yīng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)氯氮平導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎出現(xiàn)嚴(yán)重的心臟毒性，一些表型如心率下降和水腫與臨床表現(xiàn)類似。鑒于氯氮平對(duì)于治療難治性精神失常的明顯療效，臨床上仍廣泛使用。藥物的心臟毒性作用在心電圖上會(huì)有預(yù)示[15]，故使用氯氮平時(shí)應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)患者心電圖。通過(guò)實(shí)時(shí)觀察服藥后的癥狀，及時(shí)通過(guò)心電圖來(lái)預(yù)測(cè)心臟病變，可以在一定程度上彌補(bǔ)氯氮平的不良反應(yīng)，繼續(xù)發(fā)揮其治療精神疾病的優(yōu)勢(shì)效果。斑馬魚(yú)胚胎的心電圖報(bào)道很少，在未來(lái)研究中，我們擬增加心電圖指標(biāo)，檢測(cè)藥物心臟毒性。利用斑馬魚(yú)模型研究氯氮平的毒性反應(yīng)和毒性機(jī)制，可為尋找緩解或者拮抗其副作用的藥物，提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。今后的研究，可從聯(lián)合用藥角度，篩選保持其療效，同時(shí)降低心臟毒性的藥物，提高其用藥安全性，為氯氮平臨床使用提供更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝本實(shí)驗(yàn)的參加人員。)