陳向齊，宋洪濤，陳勝平，林 兵，劉志宏，昊 霞，翁巧玲

痤瘡（acne）是一種慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于青少年，發(fā)病率高達70%～87%。痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）是引起痤瘡的主要病原體。該菌寄生于皮膚毛囊及皮脂腺，屬革蘭陽性厭氧短桿菌，一般情況下為皮膚正常菌群。當青春期來臨時，毛囊口被角栓堵塞，而皮脂腺分泌功能更旺盛，局部厭氧條件、脂肪酸等成分助長了痤瘡丙酸桿菌的過度繁殖，從而使其致病。巨噬細胞是固有免疫的免疫效應細胞中的一員，通過固有的模式識別受體對入侵的病原體的病原相關分子模式進行識別，結合后將信號轉導到細胞內，激活核轉錄因子（NF）-κB，啟動相關靶基因轉錄，表達趨化因子、細胞因子，如NO、白細胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α，使巨噬細胞激活，發(fā)揮吞噬和殺傷活性[1]。巨噬細胞在先天性免疫和獲得性免疫應答中起重要作用[2]。2004年Holland等[3]發(fā)現，無瘢痕傾向的痤瘡患者早期炎癥皮損中有大量CD4+T淋巴細胞、巨噬細胞和朗格漢細胞等細胞浸潤，大量表達人類白細胞抗原，局部血管形成并表達血管細胞黏附分子，在24 h到達高峰，然后消退。但5-氨基酮戊酸光動力療法（5-aminolevulinicacid photodynamic therapy，5-ALA-PDT）能否對小鼠RAW264.7巨噬細胞株的吞噬活性和活性氧自由基（ROS）產生影響，本文進行了研究。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

細胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）進行培養(yǎng)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下，將小鼠巨噬細胞RAW264.7（購自上海細胞生物研究所）接種于培養(yǎng)皿中。隔天更換培養(yǎng)基，2～3 d進行一次傳代處理，0.25%胰蛋白酶消化細胞，處于對數生長期的細胞用于后續(xù)的實驗。

1.2 方法

1.2.1 滅活細菌液的準備 挑取單個痤瘡丙酸桿菌（廣東省微生物研究所，ATCC6919）的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3 d，用麥氏比濁法計數，以生理鹽水調配細菌濃度至1×108個 /ml，95 ℃水滅活 15 min。

1.2.2 實驗分組 空白組：單純RAW264.7細胞培養(yǎng)。模型組：按文獻[4]的方法，給予終濃度2.25×107個/ml濃度痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激RAW264.7細胞（2.25×105個/ml）2 h。5-ALA-PDT處理組（試驗組）：分3個濃度，分別為0.03、0.06、0.12 mmol/L。每組實驗重復3次，每次4個復孔，取均值。

1.2.3 中性紅法檢測巨噬細胞的吞噬活性 RAW264.7細胞以 1×106個/ml鋪黑色 96孔板（100 μl），置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。除空白組外，其他組給予終濃度1×108個/ml細菌滅活液刺激2 h，感染復數（multiplicity of infection，MOI）=100:1?，F配5-ALA液（上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），給予終濃度0.03、0.06、0.12 mmol/L給藥，空白組、模型組加等量的PBS液。每個濃度4 個重復孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。給予16 J/cm2的紅光照射。吸出舊的培養(yǎng)基，加入新的培養(yǎng)基100 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 h后取出。巨噬細胞的吞噬活性用中性紅法測定，吸出培養(yǎng)基，每孔加0.1%中性紅懸濁液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄去上清液，用200 μl PBS液沖洗未被吞噬的中性紅，重復3次。每孔加200 μl細胞裂解液醋酸-乙醇（1:1），靜置2 h，使細胞溶解，混勻后在酶標儀上測定 540 nm處吸光度(A)，以無細胞的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)液為調零對照。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察細胞內ROS熒光強度 RAW264.7細胞以 5×104個 /ml鋪黑色 96孔板（100 μl），置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。除空白組外，其他組給予終濃度5×106個/ml濃度細菌滅活液刺激2 h，感染復數（multiplicity of infection，MOI）=100:1。其余方法同中性紅法檢測巨噬細胞的吞噬活性。在待測試細胞培養(yǎng)基中加入二氫乙錠（dihydroethidium，DHE，上海西塘生物技術有限公司，最終濃度為10 μmol/L），在37℃5%CO2培養(yǎng)箱內孵育30 min。用預熱（37℃）的PBS沖洗3次，每次1～2 min，用熒光顯微鏡觀察細胞內的紅色熒光，并拍照。

1.2.5 活性氧自由基檢測 細胞培養(yǎng)用熒光顯微鏡觀察細胞內活性氧自由基熒光強度。各孔中加入1:1 000用無血清DMEM稀釋2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（dihydrochloride acetyl acid dichloride，DCFH-DA，上海Sigma公司）探針 30 μl（終濃度 10 μmol/L），在培養(yǎng)箱中孵育30 min后去除探針，用PBS沖洗3遍，徹底清除未結合的熒光探針。每孔加入無血清DMEM 100 μl，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在485 nm激發(fā)波長下，用熒光酶標儀進行檢測。

1.3 統計學方法

實驗數據以（xˉ ±s）表示，采用SPSS18.0統計軟件進行處理，各組間計量資料比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Tambane's T2法，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 5-ALA-PDT對痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細胞吞噬活性的影響

實驗結果表明，空白組A值為0.72±0.02，模型組A值為1.06±0.03，0.03 mmol/L組A值為0.91±0.04，0.06 mmol/L組A值為0.89±0.02，0.12 mmol/L組A值為0.76±0.01，用LSD檢驗，F=99.316，P=0.001，差異有統計學意義。模型組A值和空白組比較，P=0.001，差異有統計學意義。0.06 mmol/L組和模型組比較，P=0.001，差異有統計學意義。0.12 mmol/L組和0.03 mmol/L組比較，P=0.001，差異有統計學意義（圖1 ）。

2.2 熒光顯微鏡觀察細胞內ROS的熒光強度

圖1 5-ALA-PDT對痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細胞吞噬活性的影響

圖2 5-ALA-PDT處理對小鼠單核巨噬細胞內ROS水平的影響

圖3 5-ALA-PDT對痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細胞ROS的影響

熒光顯微鏡下顯示0.03 mmol/L 5-ALA處理組小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株有少量熒光，0.12 mmol/L5-ALA處理組熒光明顯增強，表明0.12 mmol/L 5-ALA處理組產生大量ROS（圖2）。熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光強度可見：0.03 mmol/L組細胞內只見少量微弱紅色熒光；0.12 mmol/L組細胞內有大量紅色熒光 。

2.3 5-ALA-PDT對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株ROS的影響

空白組熒光強度為0.25±0.01、模型組0.27±0.02，0.03 mmol/L 組 1.32±0.29，0.06 mmol/L 組 1.82±0.32，0.12mmol/L組2.47±0.12，用Tambane's T2檢驗F=94.865，P=0.001，差異有統計學意義。模型組和空白組比較，P=0.679，差異無統計學意義。0.03 mmol/L組和空白組比較，P=0.026，差異有統計學意義。0.12 mmol/L組和0.03 mmol/L組比較，P=0.012，差異有統計學意義（圖3）。

3 討論

光動力學療法（PDT）作為光療法的分支，是一種新興療法，用于治療痤瘡療效顯著，不良反應小，已成為目前的研究熱點[2,4]。其作用機制是在患處應用光敏劑，在光照的基礎上，可以誘導產生獨特的生物學效應，從而治愈疾病。以光敏劑5-ALA為例，5-ALA經上皮細胞及毛囊皮脂腺吸收后，可以通過血紅素合成途徑代謝為原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ），當光線照射時，PpⅨ受激發(fā)產生單態(tài)氧和自由基，使得細胞凋亡，皮脂腺萎縮，痤瘡丙酸桿菌被殺滅[5,6]。

巨噬細胞對異物，如細菌等有吞噬和消化的功能，在非特異性免疫反應中起重要作用，中性紅法可用來檢測巨噬細胞的吞噬活性。筆者的研究結果表明，用痤瘡丙酸桿菌刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞后吞噬活性增強，給予不同濃度5-ALA-PDT處理后吞噬活性均降低，隨著濃度升高，吞噬活性降低更明顯，呈劑量依賴性。表明 5-ALA-PDT能減輕小鼠RAW264.7巨噬細胞株吞噬活性，可能減輕痤瘡的炎癥反應。

ROS是生物體內含有氧原子和活性物質的總稱。除了機體的正常代謝能產生ROS外，免疫反應和抗生素等均可導致ROS水平升高。由免疫系統產生的ROS可直接殺死病原微生物，起到免疫防御作用。熒光顯微鏡能直接觀察到ROS的強度，熒光酶標儀能定量檢測ROS水平。在熒光顯微鏡下觀察到小鼠RAW264.7細胞株ROS變化情況：正常情況下小鼠巨噬細胞264.7細胞株ROS水平低，不易觀察到，5-ALA-PDT有效增加痤瘡丙酸桿菌感染后細胞內ROS水平，隨著5-ALA濃度升高，ROS水平持續(xù)升高，呈劑量依賴性?？赡苁?-ALAPDT治療后產生大量的單線態(tài)氧，使ROS水平上升，將痤瘡丙酸桿菌殺死，從而治療痤瘡。下一步研究可檢測不同處理組單線態(tài)氧等不同ROS成分水平，進一步研究5-ALA-PDT對ROS的影響。