徐 哲，林志淼

Meleda角化?。╩al de Meleda，OMIM 248390）是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的掌跖角化病（palmoplantar keratoderma，PPK），又被稱為Meleda病，由Luca Stulli首次發(fā)現(xiàn)于地中海東部的現(xiàn)屬于克羅地亞的Melada島。1898年，Neumann首次在文獻(xiàn)中報(bào)道了本病[1]，患病率約1/10萬(wàn)[2]。臨床表現(xiàn)為掌跖部位的彌漫角化增生性斑塊，手足背側(cè)和肘膝部等四肢伸側(cè)亦可受累?；颊呱蟛痪冒l(fā)病，表現(xiàn)為界限分明的掌跖角化伴炎癥反應(yīng)，有異味。常見(jiàn)的特征還包括多汗、口周紅斑、關(guān)節(jié)處苔蘚樣角化性斑塊、錐形指、短指以及指甲肥厚畸形等。其致病基因?yàn)槲挥?q24.3的SLURP1基因[3]，編碼分泌型尿激酶型纖溶酶原-LY6 /哺乳動(dòng)物受體相關(guān)蛋白1（SLURP1）。SLURP1蛋白是Ly-6蛋白超家族的一個(gè)成員，其典型特征是10個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵結(jié)構(gòu)以及類似蛇毒素的CCX4CN結(jié)構(gòu)域。SLURP1是α-7-煙堿型乙酰膽堿受體的內(nèi)源性配體，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)因子可調(diào)節(jié)表皮穩(wěn)態(tài)以及腫瘤壞死因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]。本研究收集到一個(gè)Meleda角化病家系，對(duì)家系中的成年男性患者、其父母和配偶等人，在獲得遺傳學(xué)研究的知情同意后，進(jìn)行了基因突變分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

圖1 Meleda角化病患者皮損

先證者，男，29歲。因出生時(shí)即出現(xiàn)掌跖部位紅斑、脫屑，并逐漸擴(kuò)展加重，累及手足背和肘膝部等，伴隨皮膚多汗、皸裂和瘙癢，偶爾出現(xiàn)趾縫間真菌感染而就診。1歲10月齡時(shí)，足背及肘膝部紅斑發(fā)展為淡紅色角化性略隆起的斑塊，表面粗糙，有少量角化性鱗屑。手足多汗明顯，有腥臭氣味，略瘙癢。至3歲齡時(shí)，皮損累及到口周、鼻周及臀部，口周和鼻周無(wú)明顯痛癢等不適。父母體健，非近親結(jié)婚，家族中未見(jiàn)有相似癥狀的親屬。體格檢查：全身各系統(tǒng)體檢未見(jiàn)明顯異常。皮膚科情況：雙側(cè)手掌和足跖對(duì)稱分布角化性淡黃色斑塊，增厚明顯，有皸裂伴惡臭，甲板略均勻增厚。皮損延伸至手足背部，跨過(guò)掌指（趾）關(guān)節(jié)直至手足背遠(yuǎn)端的2/3處，與正常皮膚邊界清晰，足縫見(jiàn)白色浸漬（圖1a-1c），指（趾）活動(dòng)不受限。肘、膝伸側(cè)見(jiàn)對(duì)稱分布的角化性斑塊。雙側(cè)鼻翼及口周對(duì)稱性紅斑，右側(cè)鼻翼處見(jiàn)刺樣凸起（圖1d）；肛周及會(huì)陰部對(duì)稱性邊界清晰的淡黃色角化性斑片，外緣距肛門中心6 cm左右（圖1e）。肘部皮損組織病理檢查：表皮角化過(guò)度，顆粒層增厚，棘層肥厚，可見(jiàn)少量角化不全伴銀屑病樣增生，真皮乳頭延長(zhǎng)。真皮上部毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管周圍稀疏以淋巴細(xì)胞為主的炎性浸潤(rùn)（圖2）。手足真菌鏡檢陰性。根據(jù)患者自幼出現(xiàn)皮損，進(jìn)行性加重，表現(xiàn)為累及掌跖及手足背、肘膝部等的角化性斑塊，結(jié)合組織病理改變，診斷為Meleda角化病。采用5%水楊酸軟膏外用2周，脫屑減少，皮損角化增生未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)。

1.2 方法

圖2 Meleda角化病患者肘部皮損組織病理（HE染色×100）

1.2.1 外周血DNA提取 抽取患者及其父母以及配偶共4人外周血各2 ml，另100例健康人外周血作為對(duì)照，血液標(biāo)本2%EDTA抗凝?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺?，采用QIAGEN 全血基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國(guó)），按照說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA。使用NanoDrop2000C超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）進(jìn)行DNA濃度及純度測(cè)定。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物設(shè)計(jì)及SLURP1基因的DNA序列擴(kuò)增 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中基因SLURP1的DNA序列（NC_000008.11）及PCR引物設(shè)計(jì)原則，采用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)特異性引物，共3對(duì)。交由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系25 μl，反應(yīng)體系中包括2×LA Taq Premix（Takara，日本）12.5 μl,10 μmol/L上下游引物各1 μl，基因組DNA模板1 μl（50～ 500 ng/μl）。PCR 反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性 3 min ；94 ℃ 30 s，退火 30 s，72 ℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán) ；72 ℃延伸 7 min。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析純化后的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用熒光標(biāo)記雙脫氧末端法在ABI PRISM 3730XL（Applied Biosystems，美國(guó)）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Chromas軟件進(jìn)行序列讀取分析，其結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件與標(biāo)準(zhǔn)SLURP1序列（NM_020427）進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 SLURP1基因突變

在患者SLURP1基因第3外顯子檢測(cè)到純合突變c.256G＞A，該突變導(dǎo)致所編碼蛋白的的第86位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼幔╬.G86R）（圖3b）。

表1 SLURP1引物序列

圖3 SLURP1基因突變測(cè)序圖

2.2 突變來(lái)源分析

在患者父母檢測(cè)到SLURP1基因第3外顯子的雜合突變c.256G＞A（圖3c,3d），符合常染色體隱性遺傳的致病模式?；颊吲渑糞LURP1基因測(cè)序未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討論

Meleda角化病是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的掌跖角化病，臨床表現(xiàn)為彌漫性掌跖角化增厚，逐漸累及手足背側(cè)及肘膝部。皮膚角化性紅斑分布于口周、關(guān)節(jié)、肛周等處。常見(jiàn)因手足多汗和繼發(fā)感染引起惡臭以及指（趾）縫浸漬。皮損進(jìn)展可導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，影響手、足活動(dòng)，甚至出現(xiàn)自發(fā)的手足指（趾）假性斷指畸形。掌跖皮損其他特征還包括苔蘚樣病變、短指、甲板畸形和甲營(yíng)養(yǎng)不良等，該病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。自從19世紀(jì)該病被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，至少在19個(gè)國(guó)家地區(qū)相繼報(bào)道，包括阿爾及利亞，智利，中國(guó)，德國(guó)，印度，印度尼西亞，意大利，日本，韓國(guó)，老撾，利比亞，荷蘭，巴基斯坦，阿拉伯，蘇格蘭，瑞典，突尼斯，土耳其和阿拉伯聯(lián)合酋長(zhǎng)國(guó)等[4-9]。本病呈隱性遺傳模式，因此具有家族史常常能為診斷提供證據(jù)，散發(fā)病例相對(duì)更少。國(guó)內(nèi)該病少見(jiàn)報(bào)道，僅Zhang等[10]首次報(bào)道在兩個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)3例患兒。王艷等[11]報(bào)道1例X連鎖魚鱗病并發(fā)Melada角化病患兒，本病例為國(guó)內(nèi)報(bào)道的第3例Melada角化病。

Meleda角化病的組織病理表現(xiàn)為表皮彌漫性角質(zhì)層增生和棘層增厚，但不伴有棘層松解。某些患者可以在組織病理學(xué)方面將其作為與表皮松解性魚鱗?。╡pidermolyticichthyosis，EI） 等 其他基因相關(guān)的角化性疾病的不同之處相鑒別[12]。表皮松解性角化過(guò)度是一種組織學(xué)模式，可見(jiàn)于一些類型的掌跖角化癥、EI或表皮松解性棘皮瘤等皮膚病，主要特點(diǎn)是致密的角化過(guò)度，表皮上部棘層松解所致的裂隙或水皰，可見(jiàn)棘層松解細(xì)胞等。本病其他的組織病理表現(xiàn)為偶爾可見(jiàn)角化不全及真皮淺層少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。目前有包括彌漫性PPK、彌漫性殘毀性PPK、外胚葉發(fā)育不良伴PPK等超過(guò)25種掌跖呈角化性皮損的PPK，但需要與Meleda角化病相鑒別的主要是殘毀性皮膚角化?。ㄓ址QOlmsted綜合征）和長(zhǎng)島型掌跖角化病[9]。前者呈常染色體顯性遺傳，臨床表現(xiàn)為累及口周及掌跖的紅斑和角化，皮損極為嚴(yán)重，在兒童期就可以發(fā)生斷指等癥狀，脫發(fā)和劇烈瘙癢也是其典型特征；長(zhǎng)島型掌跖角化病主要表現(xiàn)為掌跖部位均勻增厚的紅斑角化，伴有遇水后掌跖發(fā)白、腫脹和手足多汗，皮損不隨年齡增長(zhǎng)而加重，通?？谥艿炔课徊皇芾?。

Meleda角化病為編碼SLURP1蛋白的基因SLURP1突變所致。SLURP1位于8q24.3，由3個(gè)外顯子組成。SLURP1蛋白是分泌型Ly-6/uPar蛋白超家族中的一員，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，5個(gè)雙硫鍵，廣泛分布于人體皮膚，尤其是掌跖的角質(zhì)形成細(xì)胞，可以提高煙堿型乙酰膽堿a7受體在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中激活凋亡、誘導(dǎo)分化的作用[13]，參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。當(dāng)SLURP1基因突變失活時(shí)，由于角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡異常，導(dǎo)致皮膚高度角化，同時(shí)由于SLURP1具有抑制巨噬細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α的功能，SLURP1失活是引起長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)的誘因[13]。目前，全世界已檢測(cè)到16個(gè)SLURP1基因的突變位點(diǎn)[10]，此前中國(guó)大陸人群中僅檢測(cè)到3例患者以及1例X連鎖魚鱗病并發(fā)Melada角化病患者的SLURP1突變。其中在兩個(gè)無(wú)關(guān)家系均檢測(cè)到c.256G＞A的突變[10]，王艷等[11]在X連鎖魚鱗病并發(fā)Melada角化病患者檢測(cè)到c.286C＞T的突變，患者均為純合突變。本研究中患者所檢測(cè)到的突變?yōu)閏.256G＞A純合突變，突變來(lái)自于雜合的父母攜帶者，但是父母之間的近親關(guān)系未知。該突變與之前在中國(guó)大陸發(fā)現(xiàn)的突變一致，p.G86R也曾在韓國(guó)，中國(guó)臺(tái)灣以及中東等地區(qū)的患者中發(fā)現(xiàn)[10,14]，提示突變熱點(diǎn)的存在。既往認(rèn)為Meleda角化病在Meleda島以及中東和地中海地區(qū)發(fā)病率較高，原因是這些地區(qū)，特別是海島城市中近親婚配常見(jiàn)，血緣關(guān)系較近，提示存在祖先效應(yīng)。突變所在的第86位甘氨酸位于高度保守結(jié)構(gòu)域，變?yōu)榫彼岷罂赡芡ㄟ^(guò)改變蛋白結(jié)構(gòu)，影響表皮穩(wěn)態(tài)以及免疫功能的調(diào)節(jié)，進(jìn)而引起患者臨床表現(xiàn)。

本研究在一個(gè)Meleda角化病家系中檢測(cè)到成年男性SLURP1基因的純合錯(cuò)義突變c.256G＞A（p.G86R），該突變?cè)趪?guó)外曾被報(bào)道，國(guó)內(nèi)為第2次報(bào)道。既往中國(guó)大陸首次報(bào)道的3例患者均為年齡較小的患兒（2歲、4歲和11歲）[10]。本文患者突變來(lái)自于雜合的父母攜帶者，從基因水平上證實(shí)了臨床診斷，同時(shí)豐富了Meleda角化病的中國(guó)患者組成譜。由于患者配偶不攜帶突變，所以患者所生育的后代為攜帶者，為其遺傳咨詢提供了依據(jù)。以皮膚角化增生性皮損為主的魚鱗病、汗孔角化癥和PPK等皮膚病，目前主要的治療方法以潤(rùn)膚、角質(zhì)剝脫和恢復(fù)皮膚屏障功能為主，嚴(yán)重者可以選擇口服維A酸類藥物[15]。該例患者拒絕選擇口服藥物治療，目前治療僅以外用水楊酸制劑為主，效果不明顯。雖然研究顯示腫瘤壞死因子α在Meleda角化病炎癥方面起著重要作用[9]，但是找不到任何關(guān)于應(yīng)用生物或其他免疫調(diào)節(jié)劑治療這種掌跖角化性疾病的報(bào)道。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來(lái)，生物制劑有可能應(yīng)用于治療Meleda角化病等角化性疾病。