王東，丁德龍，李華

(1.常州旅游商貿(mào)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 常州 213032；2.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 青島 266100；3.揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001)

在感官方面，肉制品的風(fēng)味是決定其整體可接受性的一個(gè)重要因素。肉制品獨(dú)特的風(fēng)味，是由滋味活性成分和香味活性成分共同形成的。滋味成分一般為非揮發(fā)性物質(zhì)，但香味成分幾乎都是揮發(fā)性的。人們能否接受某種食品取決于其風(fēng)味的優(yōu)劣，而評(píng)價(jià)風(fēng)味首先是其香味。因此，揮發(fā)性風(fēng)味組分對(duì)食品總體風(fēng)味的形成起著非常重要的作用。不同風(fēng)味成分的閾值對(duì)食品的累積感官屬性都有重要影響[1]。因此，分析檢測(cè)發(fā)酵兔肉醬中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，可以得到有關(guān)發(fā)酵兔肉醬微生物學(xué)、酶學(xué)以及化學(xué)等方面的重要信息[2]。

1 材料與方法

1.1 原材料及菌種

菌種：植物乳桿菌L21、葡萄球菌C5；

原料：無(wú)土腥味野兔肉，由鹽城市食為天野兔專業(yè)合作社提供；輔料：葡萄糖、蔗糖(A.R.級(jí))；食鹽、脫皮芝麻、香辣醬、豆豉，均為市售食品級(jí)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、復(fù)合式75 μm CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；TR-5MS石英毛細(xì)管柱、Trace DSQ II 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Trace GC Ultra氣相色譜儀 美國(guó)Thermo公司；HSX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

基本配方：兔肉、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、水12%、豆豉4%、脫皮芝麻2%、四川香辣醬4%。

制作方法：兔肉解凍→預(yù)處理→絞碎→拌料(加蔗糖、葡萄糖、食鹽和水)→接種→發(fā)酵→拌料(加豆豉、芝麻和香辣醬)→真空包裝(高溫蒸煮袋)→滅菌→成品。

發(fā)酵劑菌液制備：對(duì)篩選菌株進(jìn)行糖類發(fā)酵試驗(yàn)，采用生化反應(yīng)管檢驗(yàn)，通過(guò)觀察菌株對(duì)各種糖的利用情況確定其屬種。將待鑒定菌株接種于生物反應(yīng)管后于30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的顏色是否變化，若變?yōu)辄S色，則為陽(yáng)性，表明可發(fā)酵該糖并產(chǎn)酸。

操作要點(diǎn)：①兔肉預(yù)處理：將冷凍兔肉置于室溫下解凍約4 h，清洗，去筋膜，絞碎。②接種發(fā)酵：肉糜中加入蔗糖、葡萄糖、食鹽和水，混勻，添加發(fā)酵劑，再混勻攪拌。③發(fā)酵：密封，避光，于適宜條件下發(fā)酵。④拌料：發(fā)酵完成后，添加豆豉、芝麻和香辣醬等調(diào)味制醬。⑤包裝滅菌：將發(fā)酵成熟的兔肉放入耐高溫的包裝袋中，真空包裝，封口，高壓鍋121 ℃滅菌20 min，同時(shí)起到熟化肉醬的作用。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取

參照Pignoli G等[3]的方法，采用靜態(tài)頂空固相微萃取(SPME)法提取風(fēng)味物質(zhì)中的揮發(fā)性風(fēng)味成分。

稱取20.0 g樣品，室溫下迅速均勻切碎后，置于萃取瓶?jī)?nèi)，錫紙封口，封口膜密封。復(fù)合式75 μm CAR/PDMS萃取頭使用前先在氣相色譜進(jìn)樣口(250 ℃)老化20 min，插入密封的萃取瓶，萃取纖維頭探伸至樣品上部的頂空中，在60 ℃水浴條件下吸附40 min，以備進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定

將萃取頭插入進(jìn)樣口(250 ℃)解吸2 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，啟動(dòng)儀器進(jìn)行分析檢測(cè)。

氣相色譜條件：色譜柱為TR-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為N2，流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度保持在250 ℃，以不分流方式進(jìn)樣。程序升溫條件：起始溫度40 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至130 ℃，8 ℃/min的速度升溫至200 ℃，12 ℃/min的速度升溫至250 ℃，保持7 min。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，能量為70 eV，溫度為200 ℃；接口溫度為250 ℃；檢測(cè)器電壓為350 V；發(fā)射電流為150 μA；掃描范圍為33～500 amu。

1.3.4 圖譜分析

定性分析：經(jīng)GC-MS分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)NIST Library中的數(shù)據(jù)，對(duì)各色譜峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行人工分析和檢索，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性，確定揮發(fā)性成分。

定量分析：各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量用其在圖譜中對(duì)應(yīng)的峰面積和峰面積百分比例表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔肉醬發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較

發(fā)酵前后樣品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物總離子流色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 兔肉醬發(fā)酵前揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of flavor components in unfermented rabbit meat paste

圖2 兔肉醬發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of flavor components in fermented rabbit meat paste

對(duì)未發(fā)酵兔肉醬和發(fā)酵兔肉醬的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析比較，相對(duì)峰面積≥0.2%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵前后兔肉醬的風(fēng)味成分分析Table 1 Flavor components analysis of rabbit meat paste before and after fermentation

續(xù) 表

本試驗(yàn)對(duì)接種復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵的兔肉醬和未發(fā)酵的對(duì)照樣品進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測(cè)和分析。由表1可知，發(fā)酵組樣品中共檢測(cè)出相對(duì)峰面積≥0.2%的揮發(fā)性風(fēng)味化合物48種，未發(fā)酵組樣品中共檢測(cè)出42種，這些揮發(fā)性成分主要是醇類、醛類、酸類、烴類、酮類、酯類、醚類和雜環(huán)類。

表2 樣品中各類化合物相對(duì)百分含量Table 2 The relative percentage of compositions in samples

由表2可知，未發(fā)酵組中包括醇類7種，相對(duì)百分含量23.84%；醛類13種，相對(duì)百分含量25.43%；酸類3種，相對(duì)百分含量1.61%；烴類6種，相對(duì)百分含量3.44%；酮類4種，相對(duì)百分含量1.31%；酯類4種，相對(duì)百分含量1.90%；醚類3種，相對(duì)百分含量1.09%；雜環(huán)類化合物2種，相對(duì)百分含量7.42%。

發(fā)酵組樣品中包括醇類7種，相對(duì)百分含量19.94%；醛類15種，相對(duì)百分含量24.68%；酸類4種，相對(duì)百分含量2.23%；烴類9種，相對(duì)百分含量5.87%；酮類5種，相對(duì)百分含量1.24%；酯類4種，相對(duì)百分含量2.48%；醚類2種，相對(duì)百分含量2.54%；雜環(huán)類化合物2種，相對(duì)百分含量9.75%。

可以看出，在未發(fā)酵和發(fā)酵組中都是醛類化合物的種類最多，其次是醇類和烴類。由于微生物發(fā)酵劑的作用，發(fā)酵組樣品中相對(duì)含量在0.2%以上的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類發(fā)生了明顯的變化，除了酯類、醚類和雜環(huán)類化合物之外，其他化合物的種類都有不同程度的增加。有研究表明，食品中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)都可以通過(guò)各分子間相互作用吸附風(fēng)味化合物，從而影響風(fēng)味化合物的釋放，蛋白質(zhì)和脂肪的含量也會(huì)影響揮發(fā)性化合物的風(fēng)味強(qiáng)度[4,5]，溫度也會(huì)影響蛋白質(zhì)與風(fēng)味化合物的吸附常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)[6]。

2.2 兔肉醬發(fā)酵前后主體風(fēng)味物質(zhì)成分分析

由表2可知，未發(fā)酵樣品中醛類和醇類化合物是主要的風(fēng)味物質(zhì)，其次是雜環(huán)類化合物、烴類、酯類等。經(jīng)過(guò)發(fā)酵，揮發(fā)性風(fēng)味成分發(fā)生了變化，醛類仍是占比最大的一類化合物，其次是醇類、雜環(huán)類化合物和烴類，占有較大比重。在發(fā)酵過(guò)程中，部分醇類和醛類會(huì)被氧化，使醇類和醛類化合物的占比減少，而烴類和雜環(huán)類化合物的相對(duì)百分含量增加，變化較明顯。從總體上看，發(fā)酵制品的風(fēng)味得到了改善，主要的揮發(fā)性風(fēng)味成分的百分含量也發(fā)生了改變。醛類化合物為發(fā)酵制品風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，相對(duì)百分含量達(dá)到了24.68%，其次是醇類化合物(19.94%)、雜環(huán)類化合物(9.75%)和烴類化合物(5.87%)。

2.2.1 醇類化合物分析

在未發(fā)酵組和發(fā)酵組中最主要的醇類化合物都是戊醇，分別占比達(dá)到21.94%和17.66%，包括2-甲基環(huán)戊醇和3,4-二甲基-1-戊醇2種，共同檢測(cè)到的醇類物質(zhì)還有2-甲基-5-甲基乙烯基-環(huán)己醇。在未發(fā)酵組中檢測(cè)到一定量的1-辛烯-3-醇、二氫香芹醇、反,反-2,5-十二碳二烯-1-醇，而發(fā)酵組中未檢測(cè)到，說(shuō)明經(jīng)過(guò)發(fā)酵和加溫過(guò)程后，可能化合物間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)酵組中未檢測(cè)出。在發(fā)酵組中檢測(cè)到苯基乙醇、2-辛烯-1-醇、2-亞硝基-2-庚醇、2,4-癸二烯-1-醇，而未發(fā)酵組中卻沒(méi)有，表明這幾種化合物可能是在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的。

2.2.2 醛類化合物分析

肉制品中的醛類化合物一般是原料中固有或酯類經(jīng)氧化分解生成的，醛類是閾值相對(duì)較低的化合物，因此也是肉類風(fēng)味物質(zhì)的重要貢獻(xiàn)者。發(fā)酵組和未發(fā)酵組中共同檢測(cè)到的醛類物質(zhì)包括壬醛、辛醛、癸醛、十六醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2-壬烯醛、2-庚烯醛和苯甲醛這9種，發(fā)酵過(guò)程使得其中一些醛類物質(zhì)減少，同時(shí)也出現(xiàn)了另外一些在未發(fā)酵組中檢測(cè)不到的醛類。壬醛會(huì)呈現(xiàn)特別的脂味，辛醛一般具有清香味，庚醛具有腌肉的香味，2-庚烯酸會(huì)呈現(xiàn)油脂香味。而苯甲醛已被鑒定為烤花生的主要羰基化合物，具有令人愉悅的杏仁香、堅(jiān)果香和水果香[7]。苯甲醛是由不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸氧化降解生成的各種小分子化合物形成[8]。由表1可推知，壬醛、2-辛烯醛和庚醛對(duì)未發(fā)酵兔肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理以后，其相對(duì)百分含量大大減少，在發(fā)酵組中甚至未檢出庚醛。發(fā)酵組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的主要醛類物質(zhì)有己醛糖、壬醛、十六醛、辛醛、2,4-庚二烯醛、2-十一碳烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2,4-十碳二烯醛和苯甲醛。

2.2.3 酸類化合物分析

脂肪和磷脂的分解以及氨基酸的脫氨基作用可以產(chǎn)生酸類化合物，試驗(yàn)中共檢測(cè)到酸類化合物5種，分別為環(huán)己基-1,4,5-三羥基-3-羰基-1-羧酸、十五烷酸、乙酸、壬酸、辛酸。只有乙酸在未發(fā)酵和發(fā)酵樣品中都有檢測(cè)到。乙酸帶有刺激性氣味，揮發(fā)性強(qiáng)，具有一定的酸味。未發(fā)酵樣品中檢測(cè)到3種酸類化合物，分別是環(huán)己基-1,4,5-三羥基-3-羰基-1-羧酸(0.70%)、十五烷酸(0.56%)、乙酸(0.35%)。發(fā)酵樣品酸類化合物中十五烷酸(0.73%)和乙酸(0.69%)也占比較大，在發(fā)酵樣品中還出現(xiàn)了壬酸和辛酸，占比分別達(dá)到0.48%和0.33%。

2.2.4 酮類化合物分析

酯類的分解或者醇類的氧化都可以生成酮類化合物，試驗(yàn)中檢測(cè)到的酮類化合物共有8種，含量都不高。2-庚酮在2組樣品中都有檢測(cè)到，發(fā)酵后其占比有所下降。在未發(fā)酵組中占比最大的是環(huán)戊酮(0.39%)，發(fā)酵組中占比較大的是3-叔丁基-3-羥基苯甲酮(0.29%)和5-癸酮(0.33%)，此外，還檢測(cè)到2,4-十二碳二烯-1-酮和3-羥基-2-丁酮，分別占比0.22%和0.20%。3-羥基-2-丁酮具有奶制品香味和油脂味。

2.2.5 酯類化合物分析

試驗(yàn)中共檢測(cè)到酯類化合物7種，在2組樣品中共同檢測(cè)到的是9,12-十八碳二烯酸甲酯。乙酸乙酯在未發(fā)酵組酯類化合物中占比最大，達(dá)到0.75%。而發(fā)酵組樣品中氨基甲酸甲酯和9,12-十八碳二烯酸甲酯的貢獻(xiàn)較大，占比分別為0.74%和0.68%。此外，在發(fā)酵樣品中還檢測(cè)到一定的癸酸乙酯和辛酸乙酯。

2.2.6 其他化合物分析

碳?xì)浠衔镏饕獊?lái)源于脂肪酸烷基自由基的均裂。烴類化合物的閾值較高，所以對(duì)制品風(fēng)味的貢獻(xiàn)不顯著。試驗(yàn)共檢測(cè)到12種烴類化合物，其中，十三烷、正十五烷和2-三氟乙酰氧基十二烷是在2組樣品中共同檢測(cè)到的。在發(fā)酵組樣品中檢測(cè)出五甲基苯、苯并環(huán)庚三烯、1-亞甲基-1-氫-茚、1-甲基萘等在未發(fā)酵組中沒(méi)有檢測(cè)到的化合物。在未發(fā)酵組中，1-環(huán)丙基戊烷所占比重最大，為1.24%；在發(fā)酵組中，1-甲基萘所占比重最大，為1.52%。

雜環(huán)化合物的閾值較低，是肉品中重要的風(fēng)味化合物，氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)可產(chǎn)生雜環(huán)類化合物及含氮含硫物質(zhì)[9]。呋喃和吡嗪是美拉德反應(yīng)的特征性產(chǎn)物，具有肉品的烘烤風(fēng)味。在2組樣品中都檢測(cè)到含量較高的2-戊基呋喃，在未發(fā)酵組和發(fā)酵組中分別占比6.14%和9.38%。在發(fā)酵組樣品中出現(xiàn)3-(1-環(huán)戊烯基)呋喃，占比為0.37%，這與研究發(fā)現(xiàn)的肉品風(fēng)味中起作用的呋喃類物質(zhì)基本一致。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)用GC-MS方法對(duì)未發(fā)酵和發(fā)酵的兔肉醬樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析，共檢測(cè)出相對(duì)峰面積≥0.2%的揮發(fā)性風(fēng)味化合物68種。

發(fā)酵樣品中檢測(cè)出48種，包括醇類7種、醛類15種、酸類4種、烴類9種、酮類5種、酯類4種、醚類2種、雜環(huán)類化合物2種，其中醇類占19.94%，醛類占24.68%，酸類占2.23%，烴類占5.87%，酮類占1.24%，酯類占2.48%，醚類占2.54%，雜環(huán)類化合物占9.75%；未發(fā)酵樣品中檢測(cè)出42種，包括醇類7種、醛類13種、酸類3種、烴類6種、酮類4種、酯類4種、醚類3種、雜環(huán)類化合物2種，其中，醇類占23.84%，醛類占25.43%，酸類占1.61%，烴類占3.44%，酮類占1.31%，酯類占1.90%，醚類占1.09%，雜環(huán)類化合物占7.42%。

微生物發(fā)酵劑的作用使發(fā)酵樣品中相對(duì)含量在0.2%以上的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類或含量發(fā)生了顯著的變化，除了酯類、醚類和雜環(huán)類化合物之外，其他化合物的種類都有不同程度的增加，表明發(fā)酵劑對(duì)兔肉醬風(fēng)味的改善有明顯效果。

在未發(fā)酵組和發(fā)酵組中最主要的醇類化合物都是戊醇，分別占比21.94%和17.66%，共同檢測(cè)到的醇類物質(zhì)還有2-甲基-5-甲基乙烯基-環(huán)己醇；共有的醛類化合物有9種，但相對(duì)含量發(fā)生了顯著變化。發(fā)酵組中的主要醛類物質(zhì)有己醛糖、壬醛、十六醛、辛醛、2,4-庚二烯醛、2-十一碳烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2,4-十碳二烯醛和苯甲醛；酸類、酮類、酯類的種類和占比都比較少；烴類的種類較多，但對(duì)風(fēng)味的影響不顯著；2組樣品中都檢測(cè)到含量較高的雜環(huán)類化合物2-戊基呋喃，在發(fā)酵組樣品中檢測(cè)到3-(1-環(huán)戊烯基)呋喃。