崔 蕊,方 玲,謝 風(fēng)

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

中性粒細(xì)胞是機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中的一條非常重要的防線，它參與機(jī)體的免疫反應(yīng)主要是在病原體感染時，通過吞噬、脫顆粒來抵抗侵襲，形成吞噬體后，在內(nèi)部通過NADPH[1]形成具有高濃度的活性氧(reactive ox-ygen species,ROS)和抗菌蛋白可以用來殺滅病原微生物，而在2004年，Brinkmann等[2]首次研究證明，當(dāng)受到病原體刺激后，中性粒細(xì)胞可以將顆粒蛋白和去致密化染色質(zhì)排除細(xì)胞外，從而捕獲并殺死病原微生物，并將這一免疫過程稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕。在2007年，Steinberg和Grinstein[3]將中性粒細(xì)胞這種被發(fā)現(xiàn)介于壞死和凋亡的死亡方式稱為：NETosis(Neutrophil Extracellular Traps)。NETosis被認(rèn)為是一種中性粒細(xì)胞免疫應(yīng)答的新方式[4]。同時我們發(fā)現(xiàn)，NETs不僅被認(rèn)為是一種全新的免疫方式，當(dāng)NETs的形成與清除不能達(dá)平衡，或結(jié)構(gòu)異常時，則參與多種自身免疫病[5]，同時，經(jīng)試驗證明NETs與血栓形成、動脈粥樣硬化，甚至腫瘤轉(zhuǎn)移都有密切關(guān)系。

1 NETs的形成及構(gòu)成

從形態(tài)學(xué)的角度 ，NETosis的主要特點是①顆粒的獲得②核結(jié)構(gòu)的改變。它是一個完全不同于壞死和凋亡的程序性死亡的過程。在NETs的形成過程中有一些酶也起到很重要的作用，如NADPH過氧化物酶、細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶 C和活性氧[6]等。但是，目前也有觀點認(rèn)為：研究證明[7]：NETosis產(chǎn)生過程有兩種不同的機(jī)制：因為刺激而自我殺死性質(zhì)的NETosis以及因為活性細(xì)胞產(chǎn)生的NETosis。NETs是有解聚的DNA以及細(xì)胞蛋白構(gòu)成，主要由24種分別來自細(xì)胞顆粒、胞漿、胞核，組蛋白質(zhì)量比約占70%。電鏡下可見，纖維網(wǎng)的基本骨架是直徑約為17 nm的染色質(zhì)(組蛋白與DNA)，鑲嵌著直徑約為50 nm顆粒蛋白等顆粒狀物質(zhì)[8]，NETs成型以后可以以線性、網(wǎng)狀、膜狀等各種形態(tài)圍繞在中性粒細(xì)胞的周圍，或者以片狀、棉絮等形狀游離在血液、肺泡腔等，可見其形態(tài)可以受空間血流等影響[9]，研究證明[10-12]，巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞也可產(chǎn)生網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)發(fā)揮一定的免疫作用。

2 NETs的免疫原性

宿主來源或者某些外源的物質(zhì)如細(xì)菌、真菌等均可以刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs[13]，比如：12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇可以在短時間內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生NETs，因此，它是體外實驗常用到的NETs體外引物。血清淀粉樣蛋白A也可以誘導(dǎo)NETs形成[14]，一些炎性介質(zhì)也可以誘導(dǎo)NETs的生成[15]。在引物誘導(dǎo)下，蛋白激酶C在活化后可以通過絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶 /絲裂素活化蛋白激酶激酶 /細(xì)胞外的信號調(diào)節(jié)激酶信號通路磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，生成 NETs 形成所需ROS。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成超氧化氧離子、過氧化氫(H2O2) 、次 氯酸( HOCl)等。HOCl是刺激 NETs 釋放的關(guān)鍵ROS成分[16]。ROS和自噬影響下的染色體解聚是NETs形成的特征之一。NE、精氨酸脫亞胺酶 4( peptidylarginine deiminase type 4 PAD4 )和髓過氧化物酶( myeloperoxidase，MPO )共同參與這一過程，尤其PAD4可催化 3 /4 的精氨酸殘基瓜氨酸化，從而減弱靜電吸引，造成組蛋白結(jié)合DNA的能力下降[17]。而NET的抗菌策略主要可以分為①將表面帶有正電荷的病原體捕獲，限制其擴(kuò)散[18]。②NETs內(nèi)含有抗菌酶及組蛋白可以殺傷病原體。③NETs內(nèi)部含有的NE可分解沙門菌等細(xì)菌的毒力因子。

3 NETs與臨床疾病

3.1NETs與感染

當(dāng)機(jī)體受到病原微生物侵害時，因為巨噬細(xì)胞等分泌的炎性因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞大量聚集在感染部位，分泌形成NETs結(jié)構(gòu)中富含的組蛋白、蛋白肽和抗菌肽等，其殺傷力強于中性粒細(xì)胞吞噬引起的殺菌效率，NETs可以對多種病原微生物都有殺滅和清除的作用，但是人體血液中存在可以降解NETs的脫氧核糖核酸酶1(Dnase1),當(dāng)此酶缺乏時，大量NETs會聚集，NETs中的多種蛋白酶和抗菌肽可以導(dǎo)致內(nèi)皮及上皮細(xì)胞的損傷，而組蛋白是造成損傷的主要原因，因為組蛋白不僅有抗菌作用，也有很強的毒性。NETs也會與炎性介質(zhì)呈協(xié)同作用，并與血小板之間正反饋激活參與急性肺損傷的發(fā)病。慢性阻塞性肺疾病是一種非常典型的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，患者的痰液中存在胞外DNA，其結(jié)構(gòu)與NETs-DNA相似[19]，證明NETosis參與COPD的過程，Ting Liu[20]等同樣證明了上面的觀點。

3.2NETs與自身免疫病

①小血管炎(ANCA-associated vasculitides,AAV)是一種自身免疫疾病，主要累及全身多個系統(tǒng)，ANCA主要作用于髓過氧化物酶(MPO)和中性粒細(xì)胞表面靶抗原蛋白酶3(PR3)是導(dǎo)致韋格納肉芽腫及多脈管炎發(fā)生的一個原因，而Kessenbrock等[21]則證實了TNF-a(腫瘤壞死因子a)可以被ANCN活化刺激產(chǎn)生NETs，NETs存在特異靶抗原PR3、MPO并呈遞給樹突狀細(xì)胞，這是一個惡性循環(huán)。②系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的中性粒細(xì)胞極易形成NETs，部分患者因為降解NETs的能力不良，機(jī)體組織會因為NETs成分持續(xù)暴露產(chǎn)生損傷，同時再次作為抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。NETs、IFN-a與炎性小體相互發(fā)生作用，可以形成病理性的反饋環(huán)路，SLE患者中性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生變異，稱為LDGs可以促進(jìn)大量炎性介質(zhì)的釋放，大量損傷內(nèi)皮細(xì)胞。③類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以多關(guān)節(jié)對稱受累的慢性炎癥性的自身免疫性疾病，主要累積小關(guān)節(jié)，陳本露等[22]選取88例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者作為實驗組，20例健康體檢者為對照組，檢測dsDNA/NETs證明RA患者血清中NETs換輛高于正常人，病人外周血中中性粒細(xì)胞PAD4mRNA表達(dá)顯著增高，且外周血中PBMCs中組蛋白瓜氨酸化顯著升高，不排除與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)，甚至與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

3.3NETs與其他相關(guān)疾病

最新研究表明NETs對血栓和凝血形成有促進(jìn)作用，NETs的ROS主要通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷來促進(jìn)血栓的形成[23]。同時又可與血小板相互作用促進(jìn)血栓的形成及提高血栓的穩(wěn)定性，并且NETs具有抵抗rt-PA對血栓誘導(dǎo)的溶解作用[24].在靜脈血栓中，NETs為靜脈血栓形成提供了一個骨架結(jié)構(gòu)很集中的細(xì)胞及刺激因素，它可以不受纖維蛋白途徑的影響[25]，同時，NETs可以刺激內(nèi)源性。動脈血栓主要由動脈粥樣硬化板塊的侵襲或者破裂引起，既往有研究[26]證明：在動脈粥樣硬化的病變中存在NETs，同樣我們我們也可觀察到NETs[27]出現(xiàn)在急性心肌梗死、腦梗死患者的新鮮溶解的血栓標(biāo)本。有研究證明[28]主要機(jī)制是存在于自體DNA和中性粒細(xì)胞內(nèi)部的克里蛋白可以活化血管壁中血漿樹突，并且I型的干擾素會同時發(fā)生反應(yīng)。據(jù)報道[29,30]，腫瘤細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管生成也可能與NETs中的多種組分有關(guān)，這為我們治療腫瘤提供了一個新思路，有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

NETs在多種疾病發(fā)病、治療方面逐漸占有重要地位。一方面，NETs可以導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生，另一方面NETs也具有診斷、預(yù)測、靶向治療、預(yù)后等作用。比如cf-DNA/NETs可以作為監(jiān)測炎性過程的重要標(biāo)志物，血漿中cf-DNA/NETs濃度水平與急性心肌梗死嚴(yán)重程度相關(guān)，急性腦梗死動脈血栓中會存在大量NETs的成分,NETs有可能為急性腦梗死溶栓治療提供了一個新的靶點。再如，NETs的循環(huán)可以被DNase或者PAD4抑制劑阻斷，這將成為抗腫瘤的一個新的靶點。但同時，我們需要控制NETs產(chǎn)生與溶解的平衡，不可以在機(jī)體中產(chǎn)生過多的NETs。綜上，我們應(yīng)深入研究NETs，避免自身免疫病的發(fā)生及一些疾病新的靶點治療。

[1]Ameta Manda,Michal P.Pruchniak,Magdelena Arazna,et al.Neutrophil extracellular traps in physiology and pathology[J].Central European Journal of Immunology,2014，39(1):16.

[2]葛 蘭.基于DNA酶的心肌缺血再灌注損傷治療新方法初探：中性粒細(xì)胞胞外核酸網(wǎng)的作用[D].天津醫(yī)科大學(xué),2013,5.

[3]Steinberg BE,Grinstein S.Unconventional roles of the NADPH oxidase: signaling，ion homeostasis,and cell death[J].Sci Stke,2007,2007(379):11.

[4]廖成水.旋毛蟲核酸酶的性質(zhì)及其在旋毛蟲逃避METs中的作用研究[D].吉林大學(xué),2014,12.

[5]Peter C.Grayson,Mariana J.Kaplan.At the Bench:Neutrophil extracrllular traps(NETs)highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases[J].J Leukoc Biol,2016,99(2):253.

[6]Hakkim A,Fuchs TA,Martinez NE,et al.Activation of the RafMEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation[J].Nat Chem Biol，2011,7(2):75.

[7]Yipp BG,Kubes P.NETosis: how vital is it[J]?Blood,2013,122(16):2784.

[8]Tyler W.R.Halverson,Mike Wilton,Karen K.H.et al.DNA Is an Antimicrobial Component of Neutrophil Extracelluar Traps[J].PLOS pathogens,2015,1(15):1.

[9]Tanaka K，Koike Y，Shimura T，et al.In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model[J].PLoS One，2014，9( 11) : e111888.

[10]盛 石,DVT患者血漿DNA含量的變化以及相關(guān)研究[D].華中科技大學(xué),2012,5.

[11]Tuan Minh Tran,April Macintyre,Martha Hawes.Escaping Underground Nets:Extracellular DNases Degrade Plant Extracelluar Traps and Contribute to Virulence of the Plant Pathogenic Bacterium Ralstonia solanacearum[J].PLOS pathogens,2016,8(1):1.

[12]Chow OA，von K ckritz-Blickwede M，Bright AT，et al.Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps[J].Cell Host Microbe，2010，8(5):445.

[13]Cooper PR，Palmer LJ，Chapple IL.Neutrophil extracellular traps as a new paradigm in innate immunity: friend or foe[J]?Periodontol,2013，63(1):165.

[14]蘇慧慧，萬春友，魏 蔚.血清淀粉樣蛋白A誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成[J].天津醫(yī)藥，2016,2(2):146.

[15]Luo L，Zhang S，Wang Y，et al.Proinflammatory role of neutrophil extracellular traps in abdominal sepsis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，307(7):L586.

[16]Nicole de Buhr,Maren von Kockritz-Blickwede.How Neutrophil Extracellular Traps Become Visible[J].Journal of Immunology Research,2016,1(1):1.

[17]許夏雨,Dnase活性受損在 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中潛在的致病作用[D].蘭州大學(xué)，2016,3.

[18]Vidal Delgado-Rizo,Marco A,Martinez-Guzman,et al.Neutrophil Extracellular Traps and Its Implications in Inflammation:An Overview[J].frontiers in Immunology,2017,2(1):1.

[19]Obermayer A,Stoiber W,Krautgartner WD,et al.New aspects on the structure of neutrophil extracellular traps from chronic obstructive pulmonary disease and in vitro generation[J].PLoS One,2014,9(5):e97784.

[20]Ting Liu,Fa-ping Wang,Geng Wang,et al.Role of Neutrophil Extracellular Traps in Asthma and Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].Chinese Medical Journal,2017,4(6):730.

[21]Kessenbrock K,Krumbholz M,Schonermarck U,et al.Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis[J].Nat Med,2009,15(6):623.

[22]陳本露.中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué)，2015,3.

[23]Haozhe Qi,Shuofei Yang,Lan Zhang.Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis[J].frontiers in Immunology,2017,8(1):1.

[24]Ashish N,RaoNayef M Kazzaz,Jason S Knight.Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases[J].World J Cardiol,2015,10(12):829.

[25]Brill A,Fuchs TA,Savcheenko AS,et al.Neutrophil extracelluar traps promote deep vein thrombosis in mice[J].J Thromb Haemost,2012,10(1):136.

[26]Dimitrios A.Stakos,Konstantinos Kambas,Theocharis Konstantinidis.Expression of functional tissue factor by neutrophil extracellular traps in culprit artery of acute myocardial infarction[J].European Heart Journal,2015,1(36):1405.

[27]de Boer OJ,Li X,Teeling P,et al.Neutrophils,neutrophil extracellular traps and interleukin-17 associate with the organisation of thrombi in acute myocardial infarction[J].Thromb Haemost,2013,109(2):290.

[28]Alexandros Mitsios,Athanasios Arampatzioglou,Stella Arelaki,et al.NeTopathies Unraveling the Dark Side of Old Diseases through Neutrophils[J].Frontiers in Immunology,2017,2(7):1.

[29]Huh SJ,Liang S,Sharma A,et al.Transiently entrapped circulating tumor cells interact with neutrophils to facilitatelung metastasis development[J].Cancer Res,2010,70(14):6071.

[30]Cools-Lartigue J,Spicer J,McDonald B,et al.Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis[J].J Clin Invest,2013,1(1):16.