張曉玲　俞慧菊　宋志剛　王蔚

摘要：【目的】了解2011—2014年間上海地區(qū)手足口病病原譜的構(gòu)成變化，掌握手足口病主要致病原的流行規(guī)律，為做好上海地區(qū)手足口病的防控工作提供參考。

【方法】采集2011年1月至2014年12月期間兩家哨點醫(yī)院臨床診斷為手足口病患兒的咽拭子、糞便、皰疹液和腦脊液，進行腸道病毒通用和分型PCR檢測。繪制上海地區(qū)2011至2014年的手足口病病原譜，分析手足口病主要致病原陽性檢出的分布規(guī)律。

【結(jié)果】共采集上海地區(qū)2.764例手足口病患兒的4.088份標(biāo)本。腸道病毒通用檢測陽性率為76.88%，主要致病原為腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇病毒A組16型（CA16）、柯薩奇病毒A組6型（CA6）和柯薩奇病毒A組10型（CA10），其陽性檢出率分別為35.78%，16.53%，17.55%和2.28%。2011年上海地區(qū)手足口病主要以EV71和CA16流行為主；2012年EV71的構(gòu)成比下降，CA6的構(gòu)成比上升；2012年10月至2013年9月期間CA6出現(xiàn)高位流行，2013和2014年主要以EV71和CA6流行為主。2014—2015年上海地區(qū)流行的CA6屬于D7亞型。

【結(jié)論】上海地區(qū)手足口病病原譜的構(gòu)成逐年發(fā)生變化，不同型別的腸道病毒呈現(xiàn)交替流行，其中CA6的構(gòu)成比增加較快，已成為上海地區(qū)手足口病的主要致病原。對引起手足口病的腸道病毒進行持續(xù)分型監(jiān)測，對上海地區(qū)手足口病的防控工作具有重要意義。

關(guān)鍵詞：手足口病；腸道病毒71型；柯薩奇病毒A組6型

中圖分類號：R373.2 文獻標(biāo)志碼：A

近年來，手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）的暴發(fā)流行已引起全球的廣泛關(guān)注。中國疾病預(yù)防控制中心法定傳染病系統(tǒng)數(shù)據(jù)顯示，2014年1月至12月，全國共報告2.778.861例手足口病例，其中501例死亡（http：//www.nhfpc.gov.cn/zhuzhan/yqxx/lists.shtml）。持續(xù)監(jiān)測手足口病病原體，了解手足口病病原譜的構(gòu)成變化并掌握手足口病主要致病原的流行規(guī)律，對做好手足口病防控工作具有重要意義。為此，2011年至2014年間，本課題組采集了臨床診斷為手足口病患兒的臨床標(biāo)本進行腸道病毒通用和分型核酸檢測，并進一步繪制了各年手足口病病原譜，分析了手足口病主要致病原的分布特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2011年1月至2014年12月，共采集兩家哨點醫(yī)院（上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院）臨床診斷為手足口病的2.764名患者的4.088份標(biāo)本，診斷依據(jù)為原衛(wèi)生部頒布的《手足口病診療指南（2010版）》。對采樣病例的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：① 發(fā)熱≥37.5℃，持續(xù)一天以上；② 伴有全身或局部的皮膚或黏膜出疹。對于重癥病例的納入標(biāo)準(zhǔn)除符合采樣病例納入標(biāo)準(zhǔn)外，還伴有肌痙攣、腦炎、心肌炎、心肺衰竭及肺水腫等一項或多項癥狀。

采集標(biāo)本放入病毒采樣管（友康基業(yè)生物科技有限公司，貨號01130803），暫存于4℃，48 h內(nèi)冷鏈運送至上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗室。

1.2 材料與方法

1.2.1 核酸抽提 以羅氏公司的核酸抽提試劑盒（High Pure Viral Nucleic Acid Kit）試劑盒抽提標(biāo)本中的病毒核酸（DNA/RNA），操作步驟按試劑盒的說明進行，抽提物用50 μL洗脫液溶解，立即置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腸道病毒通用和分型檢測 所有標(biāo)本抽提核酸后，進行腸道病毒通用檢測。腸道病毒通用陽性的標(biāo)本繼續(xù)用EV71、CA16、CA6和CA10的特異性引物和探針進行分型[1]。

1.2.3 snPCR擴增后測序分型 由EV71、CA16、CA6和CA10的特異性引物和探針檢測后未能分型的腸道病毒通用陽性標(biāo)本，再參照Nix等[2]設(shè)計的snPCR方法進行擴增，所獲的陽性產(chǎn)物送某生物科技有限公司進行雙向測序，最后通過NCBI網(wǎng)站的BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對而確定型別。

1.2.4 CA6的系統(tǒng)進化樹分析 隨機選取2011—2014年各月上海地區(qū)的CA6代表株進行VP1基因全長序列擴增，擴增引物和方法同前期發(fā)表文章[3]。同時選取GenBank中世界范圍不同年代的CA6參考序列，用ClustalX 2.0比對序列后，以MEGA 5.0軟件中的鄰近法和Kimura2-parameter模型，基于VP1全長915個核苷酸構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自舉檢驗重復(fù)1.000次。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本收集

2011年1月至2014年12月，共采集兩家哨點醫(yī)院（上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院）臨床診斷為手足口病的2.764例患兒的臨床標(biāo)本，對于重癥病例標(biāo)本，在出院前再重復(fù)采集一次。所采集的標(biāo)本類型包括咽拭、糞便、皰液和腦脊液，各年采集的標(biāo)本數(shù)見表1。

2.2 2011—2014年手足口病病原譜

對2 764例手足病患兒的標(biāo)本進行腸道病毒通用和分型檢測。結(jié)果顯示：2011年1月至2014年12月，腸道病毒通用檢測陽性率為76.88%（2 125/2.764）。檢出率最高的腸道病毒型別為EV71、CA16、CA6和CA10，其陽性率分別為35.78%（989/2.764）、16.53%（457/2.764）、17.55%（485/2.764）和2.28%（63/2.764）；除這4種主要型別的腸道病毒外，通過snPCR擴增后測序的方法檢出的其他腸道病毒型別有柯薩奇病毒A組的2、4、5、8、9、12、14型（CA2、CA4、CA5、CA8、CA9、CA12、CA14），柯薩奇病毒B組的1型（CB1）及?？刹《镜?、9型（Echo6、Echo9），占2.21%（61/2.764）；未分型的腸道病毒占2.42%（67/2.764）；陰性占23.12%（639/2.764）；另外還檢出3例混合感染病例：EV71和CA16混合感染2例，CA6和CA16混合感染1例（圖1）。

2.3 2011—2014年手足口病病原譜的構(gòu)成

由表2可見，EV71、CA16、CA6和CA10是上海地區(qū)近年來流行的手足口病主要致病原，但其構(gòu)成比逐年發(fā)生變化。2011年，上海地區(qū)手足口病的主要致病原為EV71，占46.33%（682/1.472），其次為CA16，占19.57%（288/1.472），CA6和CA10所占比例較少，分別為7.61%（112/1.472）和3.13%（46/1.472）；2012年，EV71和CA16的構(gòu)成比有所下降，為25.1%（123/490）和15.51%（76/490），而CA6所占比例上升很快，為17.55%（86/490），CA10為1.63%（8/490）；至2013年，CA6已上升為手足口病主要致病原的首位，構(gòu)成比為53.25%（195/366），EV71僅為16.67%（61/366），CA16和CA10均為2.46%（9/366）。2014年，EV71又回升至首位，構(gòu)成比為28.21%（123/436），CA6和CA16分別為21.10%（92/436）和19.27%（84/436），CA10未檢出。

2.4 手足口病主要致病原檢出的時間分布

對上海地區(qū)手足口病主要致病原EV71、CA16、CA6和CA10進行月份檢出的分析（圖2），結(jié)果顯示EV71和CA16的流行高峰常年穩(wěn)定在5～7月，EV71在5～7月的檢出率占其全年陽性檢出的39.88%（2012年）～56.91%（2014年），CA16為28.82%（2011年）～36.84%（2012年），其余月份EV71和CA16的陽性檢出相對較少；而CA6在全年各月均有不規(guī)律的陽性檢出，無明顯流行高峰；CA10在2011年的各月均有檢出，但2012至2014年期間僅有個別陽性檢出，也無明顯流行高峰。值得注意的是，CA6在2012年10月起檢出陽性率大幅上升，高位流行的情況一直持續(xù)至2013年9月，在此期間的各個月份，CA6的陽性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其他型別的腸道病毒。到2014年，EV71在4—7月有較高陽性檢出率，而隨后的8—12月，CA6的陽性檢出率又超出了EV71，手足口病的主要致病原呈現(xiàn)出了交替流行的趨勢。

2.5 2011—2014年CA6流行株的系統(tǒng)進化樹

基于136個CA6的VP1全長序列，包括2011—2014年上海地區(qū)的CA6流行株（2011年21株、2012年12株、2013年13株、2014年16株）和國際上74個CA6代表株構(gòu)建的VP1全長系統(tǒng)進化樹見圖3。根據(jù)國際上EV71的分型方法：VP1的核苷酸同源性差異在15%～20%間，為不同基因型；在4%～14%間，為不同基因亞型，我們將國際上個流行的CA6序列分為4個型：A～D，其中D型又分為7個亞型：D1～D7（核苷酸同源性為88.6%～100%）。

3 討論

中國手足口病持續(xù)流行，每年感染病例數(shù)可達百萬， 死亡病例超數(shù)百，其報告發(fā)病率和死亡率在丙類傳染病中居首位，是我國公共衛(wèi)生工作面臨的巨大挑戰(zhàn)， 對居民造成很大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。 因此，了解上海地區(qū)手足口病病原的流行規(guī)律，對預(yù)防和控制手足口病均具有重要意義。本研究采集了2011年1月至2014年12月上海地區(qū)來自兩家哨點醫(yī)院的2 764例手足口病患兒的4 088份臨床標(biāo)本，對每份標(biāo)本用腸道病毒通用核酸檢測初篩后，陽性標(biāo)本進行EV71、CA16、CA6和CA10的核酸檢測，并進一步用snPCR擴增測序的方法對未知型別的腸道病毒進行分型。其中復(fù)旦大學(xué)附屬新華醫(yī)院是本實驗室采集樣本的主要哨點醫(yī)院，上海市公共衛(wèi)生臨床中心的采樣數(shù)量很少，由于課題研究納入哨點醫(yī)院數(shù)量有限，沒有覆蓋整個上海地區(qū)。本研究獲得的上海地區(qū)手足口病病原譜可能與上海地區(qū)手足口病流行的實際總體情況可能存在一定差異。

分析2011—2014年各年手足口病病原譜的構(gòu)成，結(jié)果顯示上海地區(qū)手足口病的主要致病原已由原來的EV71和CA16變?yōu)镋V71和CA6，這與中國國內(nèi)廣州、江蘇等地近年來的研究結(jié)果一致[4-6]。此外，根據(jù)手足口主要致病原的月份分布圖：2011年全年各月都有CA6的散發(fā)病例，2012年秋季至2013年全年上海地區(qū)CA6保持高位流行，2014年CA6在秋冬季又有較高檢出率。以往國際上報道CA6在秋冬季流行[7-8]，與EV71流行高峰為夏季不同，推測可能與病毒自身對溫度的敏感性相關(guān)。

國內(nèi)外對CA6的基因型和基因亞型尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究對CA6的分型借鑒國際上EV71的分型標(biāo)準(zhǔn)[9] ，即基于結(jié)構(gòu)蛋白VP1的核苷酸序列，差異在15%～20%為基因型，差異在4%～14%為基因亞型。根據(jù)這一分型標(biāo)準(zhǔn)，我們將上海地區(qū)流行的CA6定為D7亞型，與Bian等[10]將國際上流行的CA6分為A～E型的分型方法不一致。

過去的觀點認(rèn)為，CA6通常只引起皰疹性咽峽炎，致病能力有限[11]，然而隨著2008年芬蘭CA6暴發(fā)的報道[12]，全球包括中國的多個省份都陸續(xù)報道了導(dǎo)致手足口病的CA6流行[12-24]，重癥病例、成人感染報道也較多[24-26]，可見在手足口病致病原監(jiān)測和研究中大家對CA6已逐步重視。 此外，腸道病毒在進化過程中頻繁出現(xiàn)基因重組和突變，重組變異有利于優(yōu)勢變異株的傳播流行， 從而引起疫情暴發(fā)，重組后的病毒毒力可能增強，引發(fā)重癥。 因此，分析手足口病主要致病原的基因進化情況，有助于在臨床上適時調(diào)整手足口病的防控和治療策略，也有助于藥物設(shè)計和疫苗研發(fā)。

由于目前我國研發(fā)上市的手足口病疫苗以EV71為主[27]，隨著非EV71非CA16的其他型別腸道病毒的新現(xiàn)，已開發(fā)疫苗是否有交叉保護作用，是否還需研發(fā)其他型別腸道病毒的疫苗值得深入探討。

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（收稿日期：2017-08-29 ）