胡 皓， 王 敏， 吳開春

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院內鏡中心，上海 200032； 2.第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院

胃癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，是第二大致死性腫瘤，5年生存率僅20%～30%[1-2]，僅次于肺癌。因此，胃癌的研究受到越來越多的重視。動物模型作為腫瘤機制及治療研究的重要方法，在癌癥研究中具有重要地位,特別是腫瘤原位模型,因其更加貼近和模擬腫瘤原始生長環(huán)境，相較其他模型具有獨特研究優(yōu)勢和更廣闊的應用范圍[3-4]。然而，由于胃是空腔臟器，又深植于組織內部，構造原位模型相對困難。以往報道的原位模型建立方法存在動物死亡率高、操作時間長、成瘤率低等問題。本研究建立了一套簡便的小鼠胃癌原位模型構建方法。該方法可短時間內高效制備胃癌原位模型，可為胃癌研究提供研究便利。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、動物、試劑及儀器胃腺癌細胞系SGC-7901，慢病毒包裝細胞HEK-293T由腫瘤生物學國家重點實驗室保存。6～7周齡雌性BALB/C小鼠購自北京維通利華[SCXK(京)2011-0011]，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心[SYXK(軍)2007-020]。慢病毒構建載體pWPT-GFP、pMD2.G、psPAX2、pLenti-CMV-Puro-LUC、Delta 8.9、VSVG購自Addgene公司。DMEM及質量濃度為100 g/L的胎牛血清購自Hyclone公司。Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司。Polybrene購自Millipore公司。Puromycin購自Sigma公司。D-luciferin購自Caliper公司。體視顯微鏡購自Olympus公司。小動物成像儀為IVIS Kinetic小動物成像系統(tǒng)。

1.2慢病毒包裝4×106293T于轉染前1 d鋪于10 cm平板，使用Lipofectamin 2000轉染質粒pLenti-CMV-Puro-LUC、Delta 8.9及VSVG。轉染后48 h收集細胞上清，保存于-80 ℃。感染SGC-7901前1 d將細胞鋪于6孔板，每孔細胞數量為5×105。將病毒上清與Polybrene(8 μg/ml)混合后加入細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板在32 ℃條件下1 200×g離心90 min，提高感染率。48 h后加入帶有Puromycin篩選培養(yǎng)2周。將篩選出的陽性克隆再次感染GFP病毒。GFP病毒的包裝質粒為 pWPT-GFP、pMD2.G、psPAX2。感染及包裝過程同前。GFP感染后行流式細胞分選，選出陽性克隆。至此構建雙標細胞系SGC-7901/FLUC/GFP。

1.3體外檢測SGC-7901/FLUC/GFP活性倍比稀釋法將SGC-7901/FLUC/GFP鋪于96孔板。培養(yǎng)液補足100 μl每孔。首先選取GFP濾光片組，行IVIS熒光成像。熒光成像后，移液器每孔加入3 μl 濃度為150 μg/ml的D-luciferin，行生物發(fā)光模式采集。采集信號強度使用Living Image軟件分析。

1.4原位模型建立8只6～7周齡小鼠使用異氟烷氣體麻醉后，與左正中旁線切開約0.5 cm的小切口，無齒頓頭鑷小心從腹腔內取出胃。無菌紗布周圍保護。在體視顯微鏡下，選取胃體大彎側30 G注射器小角度進針，緩慢推入含有5×105個SGC-7901/FLUC/GFP的細胞懸液約30 μl。棉簽輕壓注射口，防止溢出后，還納胃入腹腔(見圖1)。依序縫合腹膜及皮膚。術后皮膚碘伏消毒。小鼠給予含有復方去疼片的飲水3 d。飲水需每天更換以防變質。

圖1快速原位模型構建方法A：暴露胃；B：注射細胞；C：縫合

Fig1ProceduresoforthotopicgastricmodelA: exposure of stomach; B: injecting tumor cells; C: suture

1.5原位模型活體成像觀察造模小鼠3 d后給予D-luciferin 150 μg/ml。10 min運動后麻醉，置于IVIS成像暗室行生物發(fā)光成像。成像采集時間1 min。

1.6胃癌原位移植瘤的鑒定造模小鼠2周后，處死小鼠行冰凍切片及HE染色觀察造模情況，并拍照。

2 結果

2.1成功構建胃癌雙標細胞系SGC-7901/FLUC/GFP胃癌細胞SGC-7901經2次慢病毒感染及篩選、流式分選后，得到了高表達熒光素酶Luciferase及綠色熒光蛋白GFP的雙標細胞。通過生物發(fā)光實驗及熒光顯微鏡觀察，SGC-7901/FLUC/GFP可滿足后續(xù)在體觀察和分析的需要。MTT實驗證明與親本細胞生長無異(見圖2)。

2.2SGC-7901/FLUC/GFP生物活性分析倍比稀釋法將SGC-7901/FLUC/GFP鋪于96孔板，放入IVIS成像系統(tǒng)后，行熒光成像和生物發(fā)光成像。成像結果與定量分析表明，熒光信號和生物發(fā)光信號強度與細胞數目呈線性正相關(R2=0.9667，r2=0.9110)。結果提示，生物發(fā)光及熒光信號強度可作為提示腫瘤細胞數量的標志(見圖3)。

圖2胃癌雙標細胞系SGC-7901/FLUC/GFP的構建A：熒光顯微鏡觀察(100×)；B：生物發(fā)光圖像；C：MTT實驗

Fig2Establishmentofdouble-labeledgastriccancercelllineSGC-7901/FLUC/GFPA: fluorescent microscopy (100×);B: bioluminescence imaging； C: MTT assay

2.3小鼠原位模型構建及監(jiān)測小鼠原位胃癌模型構建后，第3天采用生物發(fā)光成像觀察體內腫瘤生長情況。8只小鼠均可見生物發(fā)光信號，成瘤率100%(見圖4)。生物信號未提示腹腔內種植。生物發(fā)光信號可用于長時間活體觀測腫瘤生長情況。通過定量分析可大致判斷體內腫瘤載量。

2.4胃癌原位模型的組織學分析2周后處死造模小鼠，觀察造模情況。腫瘤呈現外生性生長表現。HE染色和冰凍切片結果顯示，腫瘤生長狀態(tài)良好，癌細胞呈巢樣生長，細胞形態(tài)一致,核深染(見圖5)。

3 討論

早在1969年,RYGAARD等[5]就首次成功創(chuàng)建了人類腫瘤裸鼠皮下移植模型。然而隨著人們研究的深入，發(fā)現皮下移植瘤脫離了腫瘤生長的原發(fā)部位，并不能真實模擬腫瘤在原位的生物學行為和特點。而采用原位建模的方式則盡可能貼近腫瘤原發(fā)部位的環(huán)境[6]。

圖3 SGC-7901/FLUC/GFP成像分析 A～B：生物發(fā)光成像及其線性分析；C～D：熒光成像及其線性分析Fig 3 Imaging evaluation of SGC-7901/FLUC/GFP A-B: bioluminescence imaging and its linear analysis; C-D: fluorescent imaging and its linear analysis

圖4 原位胃癌模型生物發(fā)光檢測Fig 4 Bioluminescence imaging of orthotopic gastric cancer

在胃癌原位模型的移植方法中，FURUKAWA等[7-8]報道的掛線法是將新鮮的腫瘤組織塊直接縫掛在漿膜層損傷的胃壁上。在此基礎上，近年又發(fā)展出荷包縫合法、OB膠、三維組織移植法等[9-12]。掛線法一方面需要將漿膜劃開，造成鼠胃不必要損傷、出血。另一方面，縫合不善易導致瘤組織脫落入腹腔，造成腹腔種植，降低成瘤率[9]。而荷包法因為需要較為復雜的手術技術，因而操作時間較長，不易掌握。無論是掛線法、荷包法，還是OB法，均是腫瘤組織在漿膜外生長，與腫瘤真實情況不同。而本研究報道的懸液注射法，操作方法簡單，建模時間短，同時克服了以往報道[8,13]成瘤率低的問題。

圖5 胃癌原位實體瘤組織分析 A：原位腫瘤生長情況；B：離體胃；C：HE染色分析(40×)；D：冰凍切片觀察GFP+腫瘤生長(40×)Fig 5 Histological analysis of orthotopic gastric cancer A: anatomical view of the gastric cancer; A: location of the tumor on stomach; B: HE stain (40×); C: frozen section showed GFP+tumor (40×)

小動物成像技術是采用分子成像技術對各種生物學變化進行定量、定性分析的新方法。小動物活體成像技術可以獲得動態(tài)、直觀圖像，同時非侵入性方法極大地節(jié)約了實驗動物[14]。本實驗采取的生物發(fā)光技術因其可以實現深部組織成像，可以非常方便地用于評價原位腫瘤建模是否成功，以及觀測腫瘤生長狀態(tài)[15-16]。我們前期研究[6]結果發(fā)現，在原位移植模型構建當天即可行生物發(fā)光成像用以判斷是否構建成功。對于無生物發(fā)光標記的其他胃癌細胞系，如BGC-823、MKN-28等，我們用上述方法同樣可以構建成功。提示本方法具有良好的穩(wěn)定性和可重復性。

實驗方案中也可采用靜脈麻醉，如常用的水合氯醛、戊巴比妥鈉、氯胺酮等。使用液體法的好處是造模中可防止長時間氣體麻醉劑對手術人員造成的潛在損傷。但液體麻醉劑量應嚴格控制，避免麻醉過量造成小鼠死亡。手術過程中及術后可使用保溫裝置，防止小鼠低體溫死亡及提高蘇醒率。此外，在注射瘤細胞過程中應緩慢進針，進針深度不易過深，如誤將瘤細胞注射入胃腔則會導致造模失敗。造模過程中應盡量防止細胞懸液外溢進入腹腔，避免潛在腹腔種植[17]。

本研究所報道的胃癌原位模型構建方法有以下特點：(1)操作步驟簡單，無復雜的手術操作步驟，不需要特別的儀器設備，便于廣大研究人員借鑒和掌握；(2)成瘤率高，成瘤率近100%；(3)建模時間短，適合大量、高效制備胃癌原位模型。因此，本方法是腫瘤機制研究及抗腫瘤藥物篩選的良好平臺及載體。