司曉光，張曉青，郝建安，杜瑾，張愛君，曹軍瑞

國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

作為一種全球性海洋災(zāi)害，赤潮已經(jīng)引起世界各國的高度關(guān)注。科研人員進(jìn)行了諸多研究和探索，以應(yīng)對(duì)頻繁發(fā)生的赤潮災(zāi)害，以期能有效地防治赤潮，減少其引發(fā)的危害和損失[1-3]。

微生物具有種類多、繁殖迅速、功能豐富等特點(diǎn)，因此在治理赤潮中具有極大的優(yōu)勢(shì)。近年來，科研人員對(duì)赤潮的微生物防治方法進(jìn)行了大量研究，取得了一些很好的成果，其中利用微生物自身分泌的具有溶藻作用的胞外物質(zhì)進(jìn)行溶藻是目前研究的熱點(diǎn)[4-6]。迄今，已報(bào)道的溶藻活性物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)類、氨基酸類、多肽類、表面活性劑、抗生素等[7-10]。

微生物產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)對(duì)環(huán)境條件的要求較高，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用有一定的影響[11-14]。為此，我們研究了本實(shí)驗(yàn)室獲得的芽孢桿菌產(chǎn)溶藻活性物質(zhì)的環(huán)境穩(wěn)定性，探討其對(duì)溫度、酸堿度、反復(fù)凍融的耐受性以及貯存時(shí)的活性衰減周期，獲得了最佳使用、運(yùn)輸和貯存條件，為該活性物質(zhì)在赤潮治理中的實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌（Bacillus）dhs-330-021為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，由dhs-330轉(zhuǎn)座突變庫篩選獲得；鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）購自上海光語生物科技有限公司，為典型赤潮藻。

dhs-330-021發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖32 g（單獨(dú)滅菌），尿素5.0 g，酵母提取物1.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.0 g，KH2PO40.8 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，微量元素溶液（CaCl27.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.0 g/L）1.0 mL，定容至1 L并調(diào)整pH至7.0，115℃滅菌30 min。

鏈狀亞歷山大藻培養(yǎng)基（f/2培養(yǎng)基）：NaNO3（75.0 g/L）1 mL，NaH2PO4·H2O（5.0 g/L）1 mL，NaSiO3·9H2O（30.0 g/L）1 mL，微量元素溶液［FeCl3·6H2O 3.15 g，Na2EDTA·2H2O 4.36 g，CuSO4·5H2O（9.8 g/L）1 mL，NaMoO4·2H2O（6.3 g/L）1 mL，ZnSO4·7H2O（22.0 g/L）1 mL，CoCl2·6H2O（10.0 g/L）1 mL，MnCl2·4H2O（180.0 g/L）1 mL，用水定容至1 L］1 mL，維生素溶液［維生素B1200 mg，維生素H（1.0 g/L）1 mL，維生素B12（1.0 g/L）1 mL，用水定容至1 L］0.5 mL，用過濾海水定容至1 L。

1.2 溶藻物質(zhì)分離

將dhs-330-021接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取50 mL，10 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，再用0.22 μm濾膜過濾至無菌藍(lán)蓋瓶中，獲得溶藻活性物質(zhì)。

1.3 溶藻物質(zhì)的溫度耐受性實(shí)驗(yàn)

將獲得的溶藻活性物質(zhì)水浴，分別加熱到20、30、40、50和60℃，保溫24 h，再冷卻至室溫，加到鏈狀亞歷山大藻的藻液中，添加量為2%，光照強(qiáng)度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔 24 h取樣，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.4 溶藻物質(zhì)的酸堿耐受性實(shí)驗(yàn)

將獲得的溶藻活性物質(zhì)用0.2 mol/L的HCl和0.2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值分別至3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，室溫放置24 h，再用0.2 mol/L的NaOH和0.2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為7.0，分別加到鏈狀亞歷山大藻的藻液中，添加量為2%，光照強(qiáng)度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取樣，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.5 反復(fù)凍融對(duì)溶藻物質(zhì)的影響

將溶藻活性物質(zhì)置于-20℃冰箱中冷凍后取出，室溫融化，反復(fù)冷凍融化5、10、15和20次，與未經(jīng)凍融的溶藻物質(zhì)對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別加到鏈狀亞歷山大藻的藻液中，添加量為2%，光照強(qiáng)度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取樣，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.6 溶藻物質(zhì)的活性衰減周期

將獲得的溶藻活性物質(zhì)于4℃冰箱中保存，分別取放置時(shí)間為0、1、3、6、9、12個(gè)月的溶藻活性物質(zhì)添加到藻細(xì)胞液中，添加量為2%，光照強(qiáng)度2500 lx，光暗比12 h∶12 h，每隔24 h取樣，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)溶藻物質(zhì)的影響

圖1結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，藻細(xì)胞密度逐漸降低，20℃處理組的藻液培養(yǎng)96 h后藻細(xì)胞密度為0.62×103/mL，與初始藻細(xì)胞密度1.83×104/mL相比，溶藻率為96.6%，而30、40、50和60℃處理組的溶藻率分別為97.2%、97.8%、89.2%和83.9%，可見在50℃以下溶藻活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較好。

圖1 處理溫度對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響

2.2 pH值對(duì)溶藻物質(zhì)的影響

從圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，處理96 h后不同pH值處理組的藻細(xì)胞密度不同，對(duì)照組和pH11處理組的藻細(xì)胞密度明顯高于其他組。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和pH11處理組的溶藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞沒有抑制作用，藻細(xì)胞均呈增加的趨勢(shì)，而pH3、pH5、pH7和pH9處理組的溶藻率分別為95.2%、95.0%、95.2%和87.5%。由此可以得出，溶藻活性物質(zhì)在強(qiáng)堿性條件（pH11）下失去溶藻活性，但能耐受弱堿和酸性條件，酸堿耐受范圍為pH3～9。

2.3 反復(fù)凍融對(duì)溶藻物質(zhì)的影響

圖3顯示了添加不同凍融次數(shù)的溶藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞密度的影響?？梢钥闯鎏砑硬煌瑑鋈诖螖?shù)的溶藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞密度有一定的影響，凍融0、5、10、15和 20次組的溶藻率分別為 97.6%、97.2%、94.3%、89.8%和86.9%，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，這表明反復(fù)凍融對(duì)溶藻物質(zhì)的活性有一定的影響，凍融15次內(nèi)仍能保持90%以上的溶藻率，可以認(rèn)為對(duì)反復(fù)凍融具有一定的耐受性。

圖2 酸堿度對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響

圖3 反復(fù)凍融對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響

2.4 溶藻物質(zhì)的活性衰減周期

圖4中的曲線表示貯存時(shí)間對(duì)溶藻物質(zhì)溶藻活性的影響，結(jié)果表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶藻物質(zhì)的活性逐漸降低，貯存6個(gè)月內(nèi)的溶藻率仍保持在90%以上，可以認(rèn)為是一種比較穩(wěn)定的溶藻物質(zhì)。

3 討論

溶藻物質(zhì)的種類繁多，結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異較大，對(duì)環(huán)境穩(wěn)定性的要求也不同。魏雅冬等發(fā)現(xiàn)的一株溶藻細(xì)菌產(chǎn)的胞外物質(zhì)具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，121℃處理后仍有很好的溶藻效果，但在強(qiáng)酸性（pH2.0）條件下喪失活性[15]。汪輝等發(fā)現(xiàn)了一株無色桿菌屬的菌株能分泌一種耐高溫和蛋白酶處理的活性物質(zhì)，該物質(zhì)能強(qiáng)烈抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)[16]。

我們對(duì)芽孢桿菌dhs-330-021產(chǎn)的溶藻物質(zhì)的環(huán)境穩(wěn)定性研究表明，該物質(zhì)對(duì)溫度的耐受性較好，隨溫度的升高溶藻率逐漸下降，50℃時(shí)仍能維持90%以上的溶藻率；同時(shí)，該物質(zhì)對(duì)溫度的變化不敏感，反復(fù)凍融15次內(nèi)，溶藻率仍大于90%。酸堿耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH3～9時(shí)該物質(zhì)的溶藻率為87.5%～95.2%，pH11時(shí)則喪失溶藻活性，具有耐酸不耐強(qiáng)堿的特性。另外，該物質(zhì)在常溫貯存條件下，溶藻活性逐漸降低，6個(gè)月內(nèi)的溶藻率仍能保持90%以上。綜上，該物質(zhì)具有很好的環(huán)境穩(wěn)定性，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，是一種具有很好應(yīng)用前景的溶藻活性物質(zhì)。

圖4 貯存時(shí)間對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響