周小琳，馮晟楠，林美嬌，歐陽(yáng)競(jìng)鋒

(1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 南陽(yáng) 473061；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院,北京 100700；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見(jiàn)而難治的慢性微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的重要原因之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外專家對(duì)糖尿病腎病的研究十分重視。但迄今為止，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)糖尿病腎病尚缺乏有效的治療方法。研究認(rèn)為，糖尿病腎病的病機(jī)是陰精不足，導(dǎo)致腎氣等化源不足，繼而產(chǎn)生痰、濕和血瘀等邪實(shí)停留病機(jī)[1]。筆者認(rèn)為，糖尿病腎病發(fā)病源于脾腎虧虛，以水濕濁毒瘀阻為標(biāo)，其臨床表現(xiàn)多與《傷寒論》少陰證相似，故以健脾利濕祛瘀為主，自擬參藤三黃湯治療糖尿病腎病。

前期的臨床研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，參藤三黃湯在減少糖尿病腎病患者尿蛋白、延緩腎病進(jìn)展和緩解癥狀方面具有很確切的療效。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察參藤三黃湯對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖、血尿素氮、腎臟病理改變以及NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element, ARE)信號(hào)通路關(guān)鍵分子等相關(guān)指標(biāo)的影響，以探索參藤三黃湯治療糖尿病腎病的可能作用靶點(diǎn)，為研制防治糖尿病腎病的有效方法和藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品和試劑

參藤三黃湯組成：黃芪60 g，黃連20 g，生地黃20 g，葛根30 g，丹參30 g，雞血藤30 g，枸杞15 g，山萸肉30 g，山藥20 g。鏈脲佐菌素 (streptozotocin，STZ) 購(gòu)自 Sigma公司 (貨號(hào)S0130)；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr) 檢測(cè)試劑盒(上?？迫A生物工程有限公司)，尿白蛋白、尿蛋白檢測(cè)試劑盒(武漢博士德有限公司)；兔抗大鼠 TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠 CTGF 多克隆抗體(武漢博士德有限公司)；厄貝沙坦片(安博維) 購(gòu)自賽諾菲(杭州) 制藥有限公司(批號(hào)5A154)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性 SD 大鼠 60 只，體質(zhì)量 160～180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào) SCXK(京) 2012-0001)，全部飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(室溫20～24 ℃，空氣相對(duì)濕度 50%～70%，晝夜循環(huán)12 h，自由進(jìn)食。

1.3 主要設(shè)備

奧林巴斯 BX51 光學(xué)顯微鏡顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，Anke TDL-40B 型低速大容量冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，PVDF 膜(美國(guó) Millipore 公司)，IX51 型顯微鏡(日本 Olympus 公司)。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立

SD 大鼠雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組10只和 STZ 誘導(dǎo)組70只，分別給予普通飼料及高脂飼料。飼養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ(60 mg/kg)誘發(fā)糖尿病，對(duì)照組則腹腔注射等體積生理鹽水。注射1周后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖，如果2次空腹血糖均超過(guò)16.7 mmol /L、尿糖陽(yáng)性、尿量大于對(duì)照組的150%、尿蛋白排泄>30 mg /24 h，可認(rèn)為糖尿病模型造模成功[4～6]。

2.2 分組及給藥

糖尿病模型動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(DN)、陽(yáng)性對(duì)照組(厄貝沙坦組)及參藤三黃湯高劑量組、參藤三黃湯中劑量組、參藤三黃湯低劑量組，正常大鼠為正常對(duì)照組。正常組10只，其他組別每組9～10只。高劑量組每日1次灌胃給予10 g/kg體質(zhì)量，中劑量組每日1次灌胃給予5 g/kg體質(zhì)量，低劑量組每日1次灌胃給予2 g/kg體質(zhì)量，厄貝沙坦組每日每只灌胃厄貝沙坦片(15 mg/kg/d)，正常對(duì)照組和模型組每日1次灌胃生理鹽水。除正常組外，其余各組大鼠繼續(xù)腹腔注射STZ(60 mg/kg)，連續(xù)12周[7-8]。用藥結(jié)束后，取部分腎組織，RT-PCR檢測(cè)Nrf2、ARE的基因和蛋白表達(dá)情況。

2.3 大鼠體質(zhì)量、血液及尿生化指標(biāo)檢測(cè)

使用DT-2000 型電子天平每周測(cè)定大鼠體質(zhì)量，使用血糖儀監(jiān)測(cè)大鼠空腹血糖。第12周，末次給藥后 24 h 禁食不禁水，收集 24 h 尿液使用Olympus AU-2700型全自動(dòng)生化分儀檢測(cè)；10% 的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血離心取上清，血清送生化儀檢測(cè)血肌酐(SCr)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL) 及白蛋白(Alb)。尿素氮和甘油三酯用試劑盒比色法檢測(cè)，血肌酐和膽固醇用酶法檢測(cè)，血糖用己糖激酶法檢測(cè)，均按照說(shuō)明書(shū)操作。

2.4 腎臟病理改變

大鼠取血結(jié)束后，手術(shù)剝離大鼠兩側(cè)腎臟，將去掉包膜的腎臟縱向剖開(kāi)，留取包括腎髓質(zhì)及腎皮質(zhì)的完整扇形組織。左側(cè)腎臟組織 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋切片(4 μm)，常規(guī) HE 染色，光學(xué)顯微鏡(×400) 觀察大鼠腎小球病理改變，使用 JEDR801D 形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件采集圖像。

2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠腎組織中Nrf2、ARE蛋白表達(dá)

腎臟組織解凍勻漿、充分裂解提取總蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品電泳轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，室溫封閉2 h，Nrf2、ARE以及β-actin一抗孵育過(guò)夜，PBS充分洗滌后，分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗滌后室溫顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、封存。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

正常組的大鼠飲食正常,體質(zhì)量增加，靈活好動(dòng),毛發(fā)光滑，排尿排便無(wú)異常。其余糖尿病腎病模型大鼠自造模日起出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量迅速減輕等臨床癥狀，大鼠精神不振，活動(dòng)減少，毛發(fā)雜亂無(wú)光澤，有脫毛現(xiàn)象，大便次數(shù)多。

3.2 常規(guī)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低，而血糖、24 h 尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮均明顯增加(P<0.01)。與模型組大鼠比較，其他各劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠血糖、24 h 尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與厄貝沙坦組比較，參藤三黃湯高、中劑量組血糖、血清肌酐、血尿素氮水平及24 h 尿蛋白定量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及血糖、血清肌酐、血尿素氮、24 h 尿蛋白水平比較

注:模型組與正常對(duì)照組比較：**P<0.01; 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.3 病理分析結(jié)果

圖1顯示，HE 染色結(jié)果正常組SD大鼠腎小球毛細(xì)血管球結(jié)構(gòu)清晰，腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)增厚、皺曲等病理改變，大鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)無(wú)炎性反應(yīng)和細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。模型組大鼠腎小球體積明顯縮小，毛細(xì)血管球結(jié)構(gòu)被破壞，部分腎小球組織纖維化樣改變，毛細(xì)血管腔狹窄，濾過(guò)膜增厚，腎小管萎縮，腎間質(zhì)血管增生。經(jīng)厄貝沙坦及參藤三黃湯干預(yù)后，大鼠腎小球病變均有所改善，毛細(xì)血管球結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，毛細(xì)血管腔狹窄狀況緩解。

圖1 參藤三黃湯對(duì)大鼠DN腎組織病理變化的影響(HE ×200)注：A． 空白組; B．DN模型組; C.厄貝沙坦組;D～F.參藤三黃湯高、中、低劑量組

3.4 各組大鼠腎組織Nrf2、ARE蛋白表達(dá)

圖2顯示，與模型組比較，厄貝沙坦組以及參藤三黃湯中劑量各組Nrf2、ARE蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與正常組比較，模型組Nrf2、ARE蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05);與厄貝沙坦組比較，參藤三黃湯各劑量組Nrf2、ARE蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 參藤三黃湯對(duì)大鼠DN腎組織Nrf2和ARE表達(dá)的影響(HE ×200)注：A． 空白組; B．DN模型組; C.厄貝沙坦組; D～F.參藤三黃湯高、中、低劑量組Nrf2, NF-E2相關(guān)因子2; ARE, 抗氧化反應(yīng)元件

4 討論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在年齡超過(guò)25周歲的2型糖尿病患者中，10.8%的糖尿病患者患有DN[9]。目前研究認(rèn)為，多種機(jī)制參與包括DN在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。盡管吡哆胺和其他新興藥物具有治療DN的效果，但是還沒(méi)有足夠的證據(jù)讓其應(yīng)用到臨床治療中[10]。近年來(lái)臨床研究顯示，中藥及中藥復(fù)方可有效地改善患者的臨床癥狀，減輕患者的 DN 損傷[11]。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“肥胖”范疇，指多飲、多食、多尿且形體消瘦。劉完素指出：“二者心膈有熱，久則引飲為消渴耳?！辈⑦x用麥門冬飲子益氣養(yǎng)陰、生津止渴治之，并著有《三消論》。認(rèn)為消渴有三：“若飲水多而小便多者，名曰消渴；若飲食多而不甚饑，小便數(shù)而漸瘦者，名曰消中；若而飲水不絕，腿消瘦而小便有脂液者，名曰腎消?！背蔀楹笫婪窒蕿樯舷⒅邢?、下消之宗本。消渴日久則生它變，一則陰損及陽(yáng)，陰陽(yáng)俱損；二則病久入絡(luò)，血脈瘀滯;三則損傷脾胃，痰飲內(nèi)生，耗傷氣陰。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)糖脂代謝紊亂導(dǎo)致糖基化終末代謝產(chǎn)物出現(xiàn)[12]、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、增加腎小球基底膜通透性、損傷血管，從而造成腎小球硬化的病理過(guò)程如出一轍?？梢?jiàn)，久虛是糖尿病腎病的發(fā)病基礎(chǔ)，邪實(shí)則是指糖尿病及其并發(fā)癥等[13-14]。

參藤三黃湯藥物組成是依據(jù)糖尿病治療應(yīng)以益氣化瘀、清熱生津、補(bǔ)腎固精為原則而立。方中黃芪味甘、性微溫，歸肺脾經(jīng)益氣固表、補(bǔ)脾益肺，為補(bǔ)氣升陽(yáng)之圣藥；丹參味苦性微寒，歸心肝經(jīng)活血涼血、祛瘀止痛；雞血藤味苦微甘、性溫，歸肝腎經(jīng)行血補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)，二者共為君藥；黃連味苦性寒，清熱燥濕，瀉火解毒；生地黃味甘苦、性寒清熱涼血，養(yǎng)陰生津；枸杞子味甘性平，歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)肝腎、益精血，為平補(bǔ)肝腎之良藥；山萸肉味酸、澀性溫，補(bǔ)益肝腎，澀精固脫；山藥味甘性平，補(bǔ)脾養(yǎng)胃，生津益肺，補(bǔ)腎澀精，為平補(bǔ)三焦良藥。尤其主要藥物黃芪、丹參兩藥合用益氣升陽(yáng)、活血化瘀，再配雞血藤補(bǔ)血活血，可氣旺血行，血行瘀散，益氣化瘀，活血通絡(luò)；生地黃配葛根清熱涼血、養(yǎng)陰生津，使熱清津生，口渴可止；黃連善清胃火，與生地黃同用能清熱瀉火、滋腎養(yǎng)陰，以解消谷善饑；枸杞子、山萸肉、山藥三藥同用平補(bǔ)肝腎，固腎澀精。全方補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，補(bǔ)而兼澀，補(bǔ)而不峻，共奏益氣升陽(yáng)、化瘀通絡(luò)、養(yǎng)陰清熱、補(bǔ)腎澀精之效。前期的研究表明，參藤三黃湯的使用可增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗，促進(jìn)胰島素分泌，增加血清胰島素的含量，促進(jìn)外周組織和靶器官對(duì)糖的利用，延緩腸道對(duì)葡萄糖的吸收，清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及糾正脂肪蛋白質(zhì)代謝紊亂，改善血流變性和微循環(huán)等。

氧化應(yīng)激是糖尿病腎病的重要發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中到氧化應(yīng)激對(duì)糖尿病腎病的影響。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在受到有害刺激時(shí)，活性氧簇 (ROS) 產(chǎn)生過(guò)多，超過(guò)了機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除能力，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)平衡紊亂和組織細(xì)胞損傷。在高糖狀態(tài)下，氧化應(yīng)激增強(qiáng)可通過(guò)多種途徑引起足細(xì)胞凋亡、腎小球?yàn)V過(guò)膜的物理屏障和電荷屏障損傷、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞外基質(zhì)聚積、蛋白尿等，誘導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。各種因素導(dǎo)致的炎癥因子聚集，引發(fā)腎小球局部纖維化，是糖尿病腎病的基本病理變化[15]。因此，提高機(jī)體抗氧化能力是減緩 DN 病情進(jìn)展的有效策略。

抗氧化因子核因子相關(guān)因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)在機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中起核心作用[16]。Nrf2屬于帽和領(lǐng)(cap‘n’collar, CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的重要作用，體內(nèi)有許多酶參與內(nèi)源性抗氧化物的活化[17]。生理?xiàng)l件下，作為Nrf2的抑制劑，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 (Keap1)與Nrf2 結(jié)合并使其位于胞漿內(nèi)，從而阻止 Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，位于胞漿內(nèi)的Nrf2 進(jìn)而被泛素化，并在蛋白酶體內(nèi)被降解；在內(nèi)外界自由基和化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，Keap1 的構(gòu)象改變或被Nrf2磷酸化，導(dǎo)致Nrf2與Keap1 解離而活化，活化的Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，啟動(dòng)ARE 下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體以及分子伴侶等基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而發(fā)揮其抗氧化、解毒以及抗炎的作用，以抵抗內(nèi)外界的有害刺激[18-19]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Nrf2的活化以及表達(dá)上調(diào)可以預(yù)防或延緩包括DN在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥。

本實(shí)驗(yàn)從糖尿病腎病大鼠模型的整體水平上，研究參藤三黃湯對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響，初步證明Nrf2 的活化可上調(diào)一系列Keap1/Nrf2 通路依賴的抗氧化基因而發(fā)揮間接抗氧化作用，從而預(yù)防和緩解包括DN在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)于深入研究Nrf2/ARE信號(hào)通路在對(duì)抗大鼠糖尿病腎病中的作用，綜合探討參藤三黃湯對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路的綜合調(diào)控機(jī)制，探究糖尿病腎病防治的新策略具有一定意義。