李 丹，脫厚珍，王佳偉，李 博，趙偉秦，王得新

(1. 北京市和平里醫(yī)院，北京 100013；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050;3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京 100730)

根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)炎性假說機(jī)制，粥樣硬化病變最初源于炎性損害導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，而后發(fā)生單核巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤[1]。根據(jù)缺血性卒中(TOAST)分型，無論大或小血管病變?cè)谄浒l(fā)病機(jī)制中均具重要地位，因此闡明導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的潛在原因或影響因素尤為重要。本研究擬通過檢測(cè)頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中人巨細(xì)胞病毒(HCMV)核酸、血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP -9的表達(dá)情況，探討上述炎性因子與動(dòng)脈粥樣硬化間的關(guān)系及HCMV感染導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的可能途徑。

1 臨床資料

1.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①癥狀性頸動(dòng)脈狹窄(既往短暫性腦缺血發(fā)作或非致殘性卒中史)且數(shù)字減影血管造影顯示狹窄程度>70%；②癥狀性頸動(dòng)脈狹窄程度>50%、局部粥樣硬化斑塊為不穩(wěn)定型斑塊(表面有潰瘍或血栓形成)；③無癥狀性頸動(dòng)脈狹窄程度>60%、粥樣硬化斑塊呈不穩(wěn)定型或伴對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈狹窄或閉塞。

1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 存在嚴(yán)重心肝腎功能衰竭者；處于明顯的免疫抑制狀態(tài)(如血液病、器官移植患者等)者；入院前4周曾有發(fā)熱或任何感染史(包括呼吸道、泌尿系、消化系統(tǒng)等)者；入院前4周曾服用過抗生素或免疫抑制劑者；年齡>75歲者；長期服避孕藥者。

1.3標(biāo)本來源 選擇1999年1月—2008年5月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院和北京大學(xué)第一醫(yī)院血管外科住院行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的31例頸動(dòng)脈狹窄患者標(biāo)本(均于手術(shù)后12 h內(nèi)取材并經(jīng)病理檢查證實(shí)為≥Ⅳ級(jí)頸動(dòng)脈粥樣硬化)作為頸動(dòng)脈粥樣硬化組，其中男26例，女5例；年齡52～67(60.35±1.83)歲；統(tǒng)計(jì)傳統(tǒng)致動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素包括高血壓19例，糖尿病6例，高三酰甘油(TG)血癥13例，血清低密度脂蛋白(LDL)>2.6 mmol/L 12例，吸煙14例，飲酒10例，有心腦血管疾病陽性家族史10例。選擇首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科腦庫提供的28例意外死亡者之正常頸內(nèi)動(dòng)脈組織標(biāo)本(均于死亡后12 h內(nèi)行尸體解剖并取材,均經(jīng)患者家屬同意)作為對(duì)照組，其中男24例，女4例；年齡55～70(63.59±1.08)歲；經(jīng)詢問家屬排除心血管疾病、免疫功能低下或免疫抑制狀態(tài)，并死亡前4周無發(fā)熱或感染病史。

1.4試劑與藥品 原位雜交試劑HCMV地高辛標(biāo)記探針來自美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)GenBank，選擇其HCMV AD169株UL75基因中的一段基因序列(5’-CGCTGAGGTCCAGGTAGTTGAAGTCCAGTGCGGCGTCGAGAAAGTCCGAGTCTTTGAGAT-3’，工作濃度20 mg/L)。原位雜交試劑盒[含地高辛標(biāo)記探針、AP檢測(cè)系統(tǒng)及蛋白酶K(1∶10)、蛋白封閉緩沖液(1∶20)、預(yù)雜交液、雜交液、封閉液、兔抗地高辛-BSA(1∶100)和AP-羊抗兔IgG(1∶100)多克隆抗體、NBT/BCIP顯色系統(tǒng)]購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APES)購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司，TritonX-100購自北京賽百盛生物工程公司。30%過氧化氫(H2O2)購自北京化工廠。免疫組織化學(xué)染色試劑中Ⅰ抗[含兔抗人MMP-9、兔抗人MMP-2和兔抗人MMP組織抑制因子-1(TIMP-1)多克隆抗體(1∶100)、鼠抗人LOX-1單克隆抗體(1∶100)]、PV-9000二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒[含3% H2O2、即用型增強(qiáng)劑(Polymer Helper)、多過氧化物酶羊抗兔/小鼠IgGⅡ抗]以及DAB顯色試劑盒分別由北京中杉金橋技術(shù)有限公司和美國R&D公司提供。

1.5儀器與設(shè)備 DK-8D型恒溫水浴箱購自上海醫(yī)療器械七廠，DGF3006型烘箱(標(biāo)準(zhǔn)溫度35～150 ℃)購自重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.6研究方法 檢測(cè)2組中HCMV DNA、LOX-1、MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)情況；統(tǒng)計(jì)頸動(dòng)脈粥樣硬化組伴及不伴危險(xiǎn)因素者HCMV DNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，HCMV DNA陽性與陰性表達(dá)者、血脂水平正常與異常者LOX-1、MMP-2、MMP-9陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6.1標(biāo)本制備 將頸動(dòng)脈管壁組織標(biāo)本(長0.50～1.50 cm)置4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋，制備層厚約5 μm連續(xù)組織切片。頸動(dòng)脈粥樣硬化組標(biāo)本經(jīng)HE染色符合≥Ⅳ級(jí)動(dòng)脈粥樣硬化改變，對(duì)照組血管未見異常病理改變。

1.6.2HCMV表達(dá)檢測(cè) 采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)。①檢測(cè)方法：組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、新鮮配制的0.5% H2O2甲醇溶液室溫下處理30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加50 μL經(jīng)稀釋的1×蛋白酶K，37 ℃孵育10 min，體積比為1%多聚甲醛溶液固定20 min，滴加50 μL預(yù)雜交液，42 ℃保育2 h，去多余液體、濕盒保濕；滴加50 μL探針/雜交工作液，覆蓋Parafilm膜切片置95 ℃恒溫水浴箱變性8 min、冰浴1 min，濕盒中42 ℃烤箱雜交過夜，洗脫蓋玻片滴加封閉液、37 ℃烘箱保育30 min；依次滴加兔抗地高辛-BSA(1∶100)和AP-羊抗兔IgG(1∶100)，37 ℃烤箱反應(yīng)60 min，滴加NBT/BCIP顯色液并于37 ℃濕盒中顯色，核固紅復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。②結(jié)果分析與判定：HCMV DNA陽性染色細(xì)胞胞核顯示藍(lán)紫色顆粒，主要見于平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞，泡沫細(xì)胞少見，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)并計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目。陽性對(duì)照為經(jīng)HE染色證實(shí)存在HCMV包涵體的小腸黏膜組織，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替探針。

1.6.3炎性因子表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)。①檢測(cè)方法：組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)后，逐次滴加Ⅰ抗(兔抗人MMP-2和MMP-9多克隆抗體和鼠抗人LOX-1單克隆抗體，37 ℃烤箱孵育2 h)、增強(qiáng)劑(37 ℃烤箱孵育20 min)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/小鼠IgG多聚體(37 ℃烤箱孵育30 min)，DAB顯色液顯色，Harris蘇木精染色液復(fù)染5 min，鹽酸-乙醇分化液分化1～2 s，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。②結(jié)果分析與判定：陽性染色細(xì)胞胞核內(nèi)呈棕黃色顆粒，主要見于平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞；隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算平均每一高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)目，利用IPP計(jì)算免疫組化陽性區(qū)域占總面積的比例(即陽性面積)及陽性區(qū)域的光密度(OD值)。陽性對(duì)照分別為乳腺癌組織MMP-2、肝臟組織MMP-9、肺組織LOX-1，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替Ⅰ抗。

2 結(jié) 果

2.1HCMV DNA表達(dá)情況 頸動(dòng)脈粥樣硬化組HCMV DNA陽性表達(dá)率為41.94%(13/31)，對(duì)照組為14.29%(4/28)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=5.393，P=0.020)；光鏡下HCMV DNA陽性表達(dá)表現(xiàn)為頸動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞胞核可見大量呈藍(lán)紫色顆粒的免疫沉積物，泡沫細(xì)胞偶見，未發(fā)現(xiàn)呈陽性染色的脂質(zhì)核及鈣化斑塊，見圖1。頸動(dòng)脈粥樣硬化組中高TG血癥、血清LDL水平>2.60 mmol/L和既往吸煙者HCMV DNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)高于相應(yīng)不伴危險(xiǎn)因素者(P均<0.05)，見表1；進(jìn)一步分析，HCMV DNA陽性者血清LDL-C和TG水平分別為(3.27±1.12)mmol/L和(3.63±0.52)mmol/L，HCMV DNA陰性者分別為(3.01±1.17)mmol/L和(1.23±0.25)mmol/L，HCMV DNA陽性者血清LDL-C水平明顯高于HCMV DNA陰性者(P=0.032)。

圖1 光鏡下頸動(dòng)脈標(biāo)本中HCMV DNA陽性染色表現(xiàn)

危險(xiǎn)因素nHCMV DNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)/(個(gè)/高倍視野)uP性別男女2650.00(2.25) 1.80(2.40)57.0000.631高血壓伴不伴19122.00(2.8)2.00(1.75)91.0000.298糖尿病伴不伴6250.00(2.8)0.00(2.2)71.0000.824高TG血癥伴不伴13182.00(3.10)0.00(0.40)50.5000.003LDL正常>2.60mmol/L19120.00(3.15)2.20(1.60)55.0000.008吸煙史無有17140.00(1.70) 2.00(3.05)71.5000.035飲酒史無有21100.00(2.00)0.09(3.55)83.0000.300心腦血管病家族史無有21100.00(2.10)0.90(2.85)90.0000.480

注：表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)(四分間距)。

2.2炎性因子表達(dá)情況

2.2.1LOX-1、MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)率動(dòng)脈粥樣硬化組中LOX-1、MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)率分別為54.80%，100%，100%，對(duì)照組分別為21.40%，67.90%，75.00%，動(dòng)脈粥樣硬化組LOX-1、MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.2.2LOX-1、MMP-2、MMP-9陽性染色表現(xiàn)LOX-1陽性染色顯示平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞胞核可見大量呈棕黃色顆粒的免疫沉積物(見圖2)，而細(xì)胞外基質(zhì)、脂質(zhì)核及粥樣硬化斑塊未發(fā)現(xiàn)同類陽性物質(zhì)。MMP-2和MMP-9陽性染色顯示平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)可見深染的棕黃色顆粒(見圖3和圖4)，以細(xì)胞內(nèi)為主，細(xì)胞外基質(zhì)少見，而脂質(zhì)核及粥樣硬化斑塊未見染色陽性的顆粒物質(zhì)。

圖2 光鏡下頸動(dòng)脈標(biāo)本中LOX-1陽性染色表現(xiàn)

圖3 光鏡下頸動(dòng)脈標(biāo)本中MMP-2陽性染色表現(xiàn)

圖4 光鏡下頸動(dòng)脈標(biāo)本中MMP-9陽性染色表現(xiàn)

2.2.3LOX-1、MMP-2、MMP-9免疫沉積物表達(dá)情況 頸動(dòng)脈粥樣硬化組LOX-1、MMP-2和MMP-9免疫沉積物表達(dá)陽性面積百分比、OD值均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。

2.2.4頸動(dòng)脈粥樣硬化組HCMV DNA陽性與陰性表達(dá)者炎性因子表達(dá)情況 HCMV DNA陽性表達(dá)者LOX-1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于HCMV DNA陰性表達(dá)者(P<0.05)，而HCMV DNA陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者M(jìn)MP-2和MMP-9陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

2.2.5頸動(dòng)脈粥樣硬化組血脂水平正常與異常者炎性因子表達(dá)情況 TG正常與升高者LOX-1、MMP-2和MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；LDL>2.6 mmol/L者LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于LDL正常者(P<0.05)。見表4。

表2 頸動(dòng)脈粥樣硬化組與對(duì)照組頸動(dòng)脈管壁LOX-1、MMP-2、MMP-9免疫沉積物表達(dá)情況

注：表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)(四分間距)。

表3 頸動(dòng)脈粥樣硬化組HCMV DNA陽性與陰性表達(dá)者炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)比較 個(gè)/高倍視野

注：表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)(四分間距)。

表4 頸動(dòng)脈粥樣硬化組血脂水平正常與異常者炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)比較 個(gè)/高倍視野

注：表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)(四分間距)。

3 討 論

目前研究證實(shí)，多種微生物或病毒均可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，其中以單核細(xì)胞等浸潤血管壁內(nèi)皮細(xì)胞為關(guān)鍵因素，這種單核細(xì)胞可運(yùn)送潛伏的HCMV到血管損傷的局部，同時(shí)HCMV被激活，隨后病毒通過激活免疫和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步推動(dòng)管壁的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[2]。Fujishiro等[3]證實(shí)腦卒中患者血清HCMV-IgG、HCMV-IgM抗體和HCMV DNA檢出率均明顯高于正常志愿者，在排除了性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、高血壓、吸煙等影響后，此種差異仍然存在。本研究亦發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化組HCMV DNA檢出率明顯高于對(duì)照組，提示其與頸動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)；且動(dòng)脈粥樣硬化組中高TG血癥、血清LDL水平>2.60 mmol/L和既往吸煙者HCMV DNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)高于相應(yīng)不伴危險(xiǎn)因素者，提示TG、LDL水平升高和吸煙可加重HCMV感染，其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。但由于本研究中31份粥樣硬化斑塊標(biāo)本均有不同程度的表面破損，加之手術(shù)切開和術(shù)中鑷子夾持損傷，以及標(biāo)本處理過程中組織皺縮和包埋的隨意性，無法觀察到完整的纖維帽形態(tài)及斑塊肩部，因此未能對(duì)HCMV在粥樣斑塊中的完整分布情況進(jìn)行定位分析。

HCMV感染機(jī)體后，可導(dǎo)致肝脂酶(HL)和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的含量或活性明顯下降，從而導(dǎo)致體內(nèi)脂代謝異常[4-5]。其中LDL-C是動(dòng)脈粥樣斑塊形成和進(jìn)展的致病因素，且與LDL-C水平相關(guān)[6]。LDL-C可被進(jìn)一步氧化為氧化型-LDL(ox-LDL)，其與LOX-1特異性結(jié)合后，可被血管壁細(xì)胞吞噬和代謝，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的合成，誘導(dǎo)血管壁炎癥反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[7-8]，而很多疾病狀態(tài)如動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂癥、高血壓、糖尿病等可上調(diào)LOX-1基因表達(dá)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈粥樣硬化組中HCMV DNA陽性者LDL-C水平和LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于陰性者，且頸動(dòng)脈粥樣硬化組LOX-1陽性檢出率、陽性面積百分比和OD值均明顯高于對(duì)照組，提示HCMV感染機(jī)體后可能通過影響血LDL-C的代謝，并進(jìn)一步上調(diào)LOX-1基因表達(dá)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。雖然本研究頸動(dòng)脈粥樣硬化組中高TG血癥者HCMV DNA陽性細(xì)胞數(shù)多，但HCMV陽性者及陰性者血TG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未得出HCMV參與動(dòng)脈粥樣硬化的過程與TG有關(guān)，但由于本研究所收集病例數(shù)不夠多，故有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究還顯示，頸動(dòng)脈粥樣硬化組中MMP-2、MMP-9陽性檢出率、陽性面積百分比和OD值均明顯高于對(duì)照組，提示MMP-2、MMP-9參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。但頸動(dòng)脈粥樣硬化組HCMV DNA陽性及陰性者M(jìn)MP-2、MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HCMV感染機(jī)體后參與動(dòng)脈粥樣硬化的過程可能不是通過影響MMP-2、MMP-9來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，HCMV感染是動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素之一，伴HCMV感染者血清LDL-C水平和動(dòng)脈中LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于無感染者，推測(cè)HCMV感染機(jī)體后可能是通過影響血LDL-C的代謝，并進(jìn)一步上調(diào)LOX-1基因表達(dá)從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展的。但由于本研究所收集病例數(shù)較少，仍需大樣本數(shù)進(jìn)一步證實(shí)。