劉娜　乞艷華　周琦

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA H19（lncRNA H19）在甲狀腺癌中的表達情況及其與臨床病理特征和預后的相關性，尋找影響甲狀腺癌治療及預后的新靶點。 方法 選取2009年1月～2012年1月從西安交大第二附屬醫(yī)院搜集的131例甲狀腺癌組織和癌旁組織為病例組，另外同期選取122例甲狀腺良性腫瘤組織作為對照組。采用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）方法檢測lncRNA H19的表達情況。之后進行5年跟蹤隨訪。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析評估lncRNA H19對甲狀腺癌的診斷價值。應用Kaplan-Meier方法計算5年累積生存率，預后相關單因素分析采用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型。 結果 與甲狀腺良性腫瘤組織及癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA H19表達升高（P < 0.05）。lncRNA H19診斷甲狀腺癌ROC曲線下面積（AUC）為0.801，診斷閾值3.58，敏感度和特異度分別為72.5%和75.4%，約登指數(shù)0.479。腫瘤直徑≥1 cm、TNM Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結轉移的甲狀腺癌組織中l(wèi)nc RNA H19表達水平明顯高于腫瘤直徑<1 cm、TNM Ⅰ+Ⅱ期及無淋巴結轉移的甲狀腺癌組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。lncRNA H19高表達者5年生存率下降（28.44%）。lncRNA H19表達水平、腫瘤直徑、TNM分期和淋巴結轉移是影響甲狀腺癌預后的獨立風險因素。 結論 lncRNA H19在甲狀腺癌組織中高表達，lncRNA H19表達水平上調與甲狀腺癌預后差相關，提示其可能是甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子調節(jié)機制之一，并可為甲狀腺癌早期無創(chuàng)診斷及治療靶點的尋找提供重要理論依據(jù)。

[關鍵詞] 甲狀腺癌；長鏈非編碼RNAs；長鏈非編碼RNA H19；預后

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0025-06

Expression status and prognostic significance of lncRNA H19 in thyroid carcinoma

LIU Na1 QI Yanhua1 ZHOU Qi1 CHENG Chuantao2 YANG Wenbin2

1.Department of Ultrasound， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiao Tong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China； 2.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiao Tong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China

[Abstract] Objective To explore the expression of long non-coding RNA H19 （lncRNA H19） in thyroid carcinoma （TC）， and its correlation with the clinicopathologic characteristics and prognosis of TC. Methods From January 2009 to January 2012， 131 TC tissues and adjacent tissues were collected from patients after thyroid surgery between as case group. Concurrently， additional 122 normal thyroid tissues from patients with benign thyroid lesions were obtained as normal control group. The expression level of lncRNA H19 were detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. five years follow-ups were conducted. Receiver operating curve（ROC） was used to evaluate the diagnostic values of lncRNA H19 for TC. The Kaplan-Meier method were employed to analyze 5-year survival rate of TC patient. Both univariate and multivariate analyses were performed to analyze the prognostic factors of TC. Results The lncRNA H19 expression was higher in TC tissues than that in the adjacent and normal tissues（P < 0.05）. The area under the ROC curve（AUC） of lncRNA H19 were 0.801. Diagnostic boundary point was 3.58. Sensitivity and specificity was 72.5% and 75.4% respectively. Youden index was 0.479. The lncRNA H19 expression in TC tissue with tumor diameter no less than 1 cm， TNM Ⅲ+Ⅳ stage， or lymph node metastasis was evidently higher than that in TC tissue with tumor smaller than 1 cm， TNM Ⅰ+Ⅱ stage， or without lymph node metastasis（P < 0.05）. The 5-year survival rate of TC patients with high lncRNA H19 expression declined （28.44%）. The expression of lncRNA H19， tumor diameter， TNM stage and lymph node metastasis were independent prognostic factors of TC patients （P < 0.05）. Conclusion The increased lncRNA H19 expression levels are associated with clinicopathologic characteristics and poor prognosis in TC patients. And it may be one of the molecular regulation mechanism in TC occurrence and development. This study also can provide basis for noninvasive diagnosis and therapeutic target searching in TC.

[Key words] Thyroid carcinoma； Long non-coding RNAs； lncRNA H19； Prognosis

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，且30年來，發(fā)病率逐漸增高，目前統(tǒng)計我國甲狀腺癌的發(fā)病率和病死率分別為0.32%和0.03%[1]。甲狀腺乳頭狀癌是主要的病理類型，占所有甲狀腺惡性腫瘤的86%[2]。甲狀腺癌根治術是目前治療甲狀腺癌的主要方式，雖然絕大多數(shù)患者手術切除后有很好的總體生存率，但也有部分患者手術治療后預后差。甲狀腺癌的侵襲特征、發(fā)生機制尚不明確，分子調控機制是一個新的思路。一個理想的生物標志物有助于早期診斷甲狀腺癌，判斷其預后情況。lncRNAs（long non-coding RNAs）一般是指大于200個核苷酸，缺少為蛋白質編碼功能的RNA[3]。已有證據(jù)表明lncRNAs與多種惡性腫瘤的發(fā)生、遷移、凋亡過程相關[4]。lncRNA H19在人胚胎組織，骨骼肌肉組織大量表達，其調節(jié)通路與許多腫瘤如胃腸道腫瘤、結腸腫瘤和膀胱腫瘤的基因凋亡有關[5]。另外，長鏈非編碼RNA相對于短鏈和中鏈非編碼RNA的研究歷史更長，數(shù)據(jù)庫較全[6]。但是，關于lncRNAs和它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色鮮有報道。因此，探索lncRNA H19與甲狀腺癌預后的相關性，期望發(fā)現(xiàn)一種新的甲狀腺癌早期診斷和預后判斷的方法，是本文的宗旨。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2009年1月～2012年1月，收集在西安交通大學第二附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行甲狀腺癌根治術的131例甲狀腺癌組織和癌旁組織（距甲狀腺癌組織3～5 cm。同期，收集122例行甲狀腺部分切除術的甲狀腺良性疾病的甲狀腺組織作為對照組。所有組織標本用10%甲醛固定并石蠟包埋，切面厚度4 μm備用。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署使用其組織樣本知情同意書。納入標準：①患者除了病理診斷為甲狀腺癌，其他器官沒有嚴重疾病。②患者尚未進行甲狀腺癌術后為期3周的放射治療。③患者術前甲功正常；④患者無其他惡性腫瘤病史或放射線暴露史。排除標準：患者有遠處轉移或肺轉移（包括合并其他腫瘤或原發(fā)性肺癌）。②患者有精神疾患或情緒不穩(wěn)定無法配合。③患者有慢性疾病如心肌梗死、腦卒中、心力衰竭和心房纖顫。④患者術前甲功不正常。⑤患者有其他惡性腫瘤病史或放射線暴露史。

病例組中，男43例，女88例；年齡15～78歲，平均（45.3±8.2）歲。對照組中，男38例，女84例；年齡20～74歲，平均（47.1±8.7）歲。兩組年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。病例組中，87例腫瘤直徑≥1.0 cm，44例腫瘤直徑< 1.0 cm；甲狀腺癌術后病理分型中，76例為甲狀腺乳頭狀癌，29例濾泡癌，26例髓樣癌；52例腫瘤突破包膜，79例腫瘤未突破包膜；根據(jù)2002年UICC指南中甲狀腺癌TNM分期[7]，51例TNM Ⅰ+Ⅱ期，80例TNM Ⅲ+Ⅳ期；69例有淋巴結轉移，62例沒有淋巴結轉移。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應

采用TRIzol法提取病例組與對照組樣本組織RNA。按照TAKARA試劑盒說明反轉錄第一個單鏈DNA（TAKARA，寶生物工程大連有限公司），合成出的cDNA作為模板用于擴增H19和GAPDH（內參基因）。PCR反應體系（20 μL）組成包括7.8 μL的雙蒸餾水，1.0 μL DNA模板，各0.4 μL上游和下游引物，0.4 μL ROX參考染料（50×），10.0 μL SYBR。反應流程：95℃條件下，預變性2 min，接著40個循環(huán)，95℃，5 s；冷卻到60℃，34 s，延伸到68℃，30 s；取各個樣本的cDNA及其相對應的引物（表1）按照以上方法混合，然后進行PCR擴增，收集熒光信號，進行熔接曲線分析，反應結束后由系統(tǒng)自動計算相對定量的結果，每個樣本重復3次。

1.3 隨訪觀察

對患者的隨訪主要通過門診復查、電話及電子郵件的方式，一般在術后第1個月進行1次，第1年每3個月隨訪1次，第2年每6個月隨訪1次，以后每1年隨訪1次，一直隨訪至2017年1月31日結束。隨訪率達到100%，所有患者相關的臨床數(shù)據(jù)都被隨訪記錄了5年。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher's 精確概率檢驗；ROC曲線評價lncRNA H19對甲狀腺癌的診斷價值；Kaplan-Meier生存曲線法及Log-Rank檢驗分析不同lncRNAH19表達程度患者5年總體生存期的差異；COX比例風險回歸模型分析lncRNAH19表達及臨床病理特征對總體生存期的影響，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lnc RNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中的表達情況

qRT-PCR結果顯示，lnc RNA H19在甲狀腺癌組織、癌旁組織及正常甲狀腺組織中表達分別為（4.02±0.85）、（3.24±0.73）和（3.07±0.81）。與癌旁組織及正常甲狀腺組織比較，lnc RNA H19在甲狀腺癌組織中表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。lnc RNA H19在癌旁組織和正常甲狀腺組織中表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 ROC曲線評價lnc RNA H19對甲狀腺癌的診斷價值

lnc RNA H19表達診斷甲狀腺癌 ROC曲線下面積0.801（P < 0.001；95%CI：0.747～0.855），診斷閾值3.58，敏感度和特異度分別為72.5%和75.4%，約登指數(shù)0.479。提示當lncRNA H19表達水平≥3.58時，甲狀腺癌發(fā)生機會增加。見圖2。

2.3 lnc RNA H19表達水平與甲狀腺癌不同臨床病理特征的關系

根據(jù)約登指數(shù)，選取靈敏度和特異度之和的最高點為截斷值，lnc RNA H19 診斷界點為3.58，≥3.58表示H19高表達，<3.58表示H19低表達。結果顯示，腫瘤直徑≥1 cm、TNM Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結轉移的甲狀腺癌組織中l(wèi)nc RNA H19表達水平明顯高于腫瘤直徑<1 cm、TNM Ⅰ+Ⅱ期及無淋巴結轉移的甲狀腺癌組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。lnc RNA H19的表達水平在不同性別、年齡、組織病理分型及包膜浸潤的甲狀腺癌組織中差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.4 lnc RNA H19表達與甲狀腺癌預后的相關性

術后隨訪5年的131例患者中，53例患者存活，78例患者死亡，死亡率為59.5%。131例患者術后病理證實，22%周圍組織侵犯，10%遠處轉移，6%對側甲狀腺轉移，40%頸部淋巴結轉移。遠處轉移的病例中，8例肺轉移，1例肝轉移，4例骨轉移，1例腎上腺轉移。其中乳頭狀癌死亡41例，髓樣癌死亡18例，濾泡狀癌死亡19例。其中64例死于該腫瘤，14例死于遠處轉移。Kaplan-Meier生存分析曲線顯示，lncRNA H19高表達者5年生存率為28.44%（27/95），低表達者5年生存率為72.2%（26/36）。見圖3。

2.5 單因素分析影響甲狀腺癌預后因素

預后相關單因素分析采用Log-rank檢驗，結果顯示腫瘤直徑≥1.0 cm，高的TNM分期和有淋巴結轉移時，平均生存率降低（P < 0.05）?？傮w生存率與性別、年齡、組織病理分型、有無包膜浸潤等臨床病理特征無明顯相關性（P > 0.05）。見表3。

2.6 多因素分析影響甲狀腺癌預后因素

采用COX比例風險回歸模型，分析lnc RNA H19表達程度、年齡、性別、腫瘤直徑、組織病理分型、有無包膜浸潤、TNM分期和淋巴結轉移與甲狀腺癌預后的關系。結果顯示lnc RNA H19表達，腫瘤直徑，TNM分期和淋巴結轉移是影響甲狀腺癌預后的獨立危險因素（P < 0.05）。年齡、性別、組織病理分型、有無包膜浸潤與甲狀腺癌預后無關（P > 0.05）。表見4。

3 討論

發(fā)現(xiàn)控制腫瘤生長、侵襲和轉移機制對腫瘤發(fā)生和腫瘤治療至關重要。本研究旨在探索lnc RNA H19表達與甲狀腺癌不同臨床病理特征的關系，及對甲狀腺癌預后影響，探索其機制，以提供更好的早期診斷和治療方式。

首先，本研究結果顯示lnc RNA H19在甲狀腺癌組織中表達較高。lnc RNA已被證實參與多種腫瘤發(fā)生[8]，lncRNAs失調影響表觀遺傳信息，發(fā)揮細胞生長優(yōu)勢，促進惡性腫瘤生長[9]。其中l(wèi)nc RNA H19是典型的例子，但它在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色鮮有報道。H19基因位于人染色體11p15，可轉錄成大小約2.3 kb的長鏈非編碼RNA，即lnc RNA H19參與基因表達的調控過程[10]，轉錄的H19保守印記基因簇也轉錄編碼胰島素樣生長因子2（IGF2），H19-IGF2基因對胚胎發(fā)育和生長控制有重要的作用，H19抑制胚胎胎盤生長，在胚胎發(fā)育過程中調節(jié)印記基因[11]。然而它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色，是致癌基因還是抑癌基因，依賴于腫瘤分型和細胞內成分[12]。

其次，本研究證實lnc RNA H19表達上調者與低表達者比較，甲狀腺癌5年生存率減低，除此之外，腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結轉移等也被證實是影響甲狀腺癌預后的獨立危險因素。有證據(jù)顯示H19在不同惡性腫瘤多種病理狀態(tài)下呈現(xiàn)高表達[13]，其表達上調表明了他的致癌屬性的可能性[14]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)了H19在膀胱癌組織中高表達，揭示了H19表達與腫瘤尺寸及淋巴結轉移相關，體外實驗證實H19能夠促進癌細胞增殖，H19表達情況在膀胱癌組織中高于其旁非腫瘤組織[16]。更進一步證實了H19在胃癌組織有高表達率，且與TNM分期和淋巴結轉移都是影響胃癌預后的獨立風險因素[17]。還有研究者通過體外實驗促進生長和轉移發(fā)現(xiàn)H19促進乳腺癌腫瘤細胞侵襲性。Raveh等[18]研究發(fā)現(xiàn)H19在上皮-間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程中起著關鍵作用，并證實H19在人類惡性腫瘤中有促進轉移的功能。p53是抑癌基因，能夠抑制腫瘤生長和轉移。p53基因突變是人類惡性腫瘤最常見的基因改變[19]，進一步討論H19與p53的關系，他們的關聯(lián)可導致P53失活，另外在膀胱癌中，H19可正向調控microrna-675（miR-675）表達，抑制P53基因活化。研究者也進一步強調H19與miR-675在胃癌發(fā)展過程中的交互作用，指出H19在在所有乳腺癌細胞系中能夠減少泛素蛋白鏈接酶E3家族（c-Cbl和Cbl-b）的表達[20]。提示lncRNA H19在預測腫瘤轉移方面有很好的預后判斷價值。

綜上所述，本研究提示，與良性甲狀腺組織和癌旁組織比較，甲狀腺組織中l(wèi)ncRNA H19的表達水平明顯增高，且lncRNA H19高表達的患者總體生存期變短。lncRNA H19表達是影響甲狀腺癌預后的獨立風險因素。這些結果表明lncRNA H19可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但由于受樣本量限制，其與甲狀腺癌患者的臨床病理特征的相關性尚不明確，因此，對未來進一步研究的期望，尚需要擴大樣本量進一步研究論證，細化腫瘤分期，繼續(xù)進行深入討論關于甲狀腺癌不同臨床病理特征的相關性的實驗。并對lncRNAH19表達情況做更進一步遠期生存率的觀察。研究lncRNAH19在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展所扮演的角色，期望發(fā)現(xiàn)一種新的甲狀腺癌早期診斷和預后判斷的方法。

[參考文獻]

[1] La VC，Malvezzi M，Bosetti C，et al. Thyroid cancer mortality and incidence： a global overview [J]. INT J Cancer，2015，136（9）：2187-2195.

[2] Deirdre K，Catherine MK. Clinical overview of thyroid cancer and recent advances in treatment [J]. J Oncol Med & Pract，2016，1（2）：1-6.

[3] Chen T，Yang P，He ZY. Long noncoding RNA H19 can predict a poor prognosis and lymph node metastasis：a meta-analysis in human cancer [J]. Minerva Medica，2016， 107（4）：251-258.

[4] Liz J，Esteller M. LncRNAs and microRNAs with a role in cancer development [J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2016，1859（1）：169-177.

[5] 趙青芳，關露露，陳小兵.長鏈非編碼RNA在胃癌中作用機制的研究進展[J].中國醫(yī)藥導報，2017，14（8）：33-36.

[6] 張明嬌，吳勇，李珉珉.長鏈非編碼RNAs的生物功能及其與器官發(fā)育和惡性腫瘤的關系[J].中國病理生理雜志，2015，31（11）：2107-2112.

[7] Kim M，Kim WG，Oh HS，et al. Comparison of the seventh and eighth editions of the American Joint Committee on Cancer/Union for international cancer control Tumor-Node-Metastasis Staging System for differentiated thyroid cancer [J]. Thyroid，2017，27（9）：1149-1155.

[8] 魏晨晨，王朝霞.長鏈非編碼RNA H19在腫瘤研究中的進展[J].臨床腫瘤學雜志，2015，20（11）：1041-1044.

[9] Liz J，Esteller M. lncRNAs and microRNAs with a role in cancer development [J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2016，1859（1）：169-177.

[10] Zhang T，Wang Y R，Zeng F，et al. LncRNA H19 is overexpressed in glioma tissue，is negatively associated with patient survival，and promotes tumor growth through its derivative miR-675 [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016， 56 20（23）：4891-4897.

[11] 許敏，呂述彥.印記基因與胎兒生長發(fā)育關系的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2016，（1）：102-104.

[12] Zhang DM，Lin ZY，Yang ZH，et al. LncRNA H19 promotes tongue squamous cell carcinoma progression through β-catenin/GSK3β/EMT signaling via association with EZH2 [J]. Am J Transl Res，2017，9（7）：3474-3486.

[13] Wang SH，Wu XC，Zhang MD，et al. Upregulation of H19 indicates a poor prognosis in gallbladder carcinoma and promotes epithelial-mesenchymal transition [J]. AM J Cancer Res，2016，6（4）：15-26.

[14] Looijenga LH，Verkerk AJ，De GN，et al. H19 in normal development and neoplasia [J]. Mol Reprod Dev，2015， 46（3）：419-439.

[15] Wang H，Men CP. Correlation of Increased Expression of MicroRNA-155 in Bladder Cancer and Prognosis [J]. Lab Med，2015，46（2）：118-122.

[16] Hua Q，Lv X，Gu X，et al. Genetic variants in lncRNA H19 are associated with the risk of bladder cancer in a Chinese population [J]. Mutagenesis，2016，31（5）：531-538.

[17] Chen JS，Wang YF，Zhang XQ，et al. H19 serves as a diagnostic biomarker and up-regulation of H19 expression contributes to poor prognosis in patients with gastric cancer [J]. Neoplasma，2016，63（2）：223-230.

[18] Raveh E，Matouk IJ，Gilon M，et al. The H19 Long non-coding RNA in cancer initiation，progression and metastasis-a proposed unifying theory [J]. Mol Cancer，2015， 14（1）：184-198.

[19] Liu C，Chen Z，F(xiàn)ang J，et al. H19-derived miR-675 contributes to bladder cancer cell proliferation by regulating p53 activation：[J]. Tumor Biol，2016，37（1）：263-270.

[20] Zhang K，Luo Z，Zhang Y，et al. Circulating lncRNA H19 in plasma as a novel biomarker for breast cancer [J]. Cancer Biomark，2016，17（2）：187-194.

（收稿日期：2018-01-18 本文編輯：任 念）