宋婷婷，王澤華，高啟坤，莊艷琴，吳齊越，吳明月

牙種植體負(fù)重能力主要取決于良好的種植體-骨界面，普遍認(rèn)為接觸成骨是該界面的理想狀態(tài)[1-2]，這種接觸方式能使周圍骨組織受力均勻, 保證種植體的長期穩(wěn)定[3-4]。成骨細(xì)胞作為錨合依賴性細(xì)胞，其在種植基材表面的黏附、叢集是接觸成骨的關(guān)鍵[5]。因此，如何提高成骨細(xì)胞在種植體表面黏附、增殖、聚集等成骨活性, 一直是該領(lǐng)域研究的熱點。該實驗以課題組前期研究獲得的成骨細(xì)胞特異性識別多肽為研究對象，探討該多肽在特定濃度下對人成骨細(xì)胞黏附、遷移作用的影響，旨為該特異性多肽對成骨細(xì)胞成骨活性的影響機(jī)制研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(杭州四季青公司)；成骨細(xì)胞特異性識別多肽(上?？齐纳锟萍加邢薰?；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺、二氧化碳孵箱(FORMA3111, 美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(DMI3000B,德國Leica公司)；流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司)；H-600IV型透射電鏡；DMEM(H)培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA(上海博光生物科技有限公司提供)；磷酸鹽緩沖液(PBS：0.01 mol/L,pH 7.4)； transwell小室(美國millpore公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人顱骨成骨細(xì)胞株購自上海撫生實驗有限公司，10% FBS、1105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d換液1次,細(xì)胞融合約80%～90%時傳代。

1.2.2細(xì)胞黏附實驗 實驗組根據(jù)條件培養(yǎng)液濃度分別為10-4mol/L組、10-5mol/L組、10-6mol/L組、10-7mol/L組、10-8mol/L組，以不含多肽的條件培養(yǎng)液作為對照組，每組6個孔，將基本長滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)條件培養(yǎng)液倒去，加入含不同濃度(10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L)的成骨細(xì)胞特異性識別多肽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對照組則加入不含多肽的培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h, 按細(xì)胞數(shù)2×104/L接種于96孔板， 共設(shè)5個時間點即0.5、1、2、4、8 h，每個時間點設(shè)6個孔。分別于相應(yīng)時間點吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定。采用體視學(xué)的方法，顯微鏡下計算孔內(nèi)黏附的細(xì)胞數(shù)目。每組記6個區(qū)域，計算出平均值(細(xì)胞個數(shù)/mm2)。

1.2.3細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗 將成骨細(xì)胞特異性識別多肽用無血清培養(yǎng)基配制成5個濃度梯度作為實驗組，不含多肽的無血清培養(yǎng)基作為對照組。取狀態(tài)良好的細(xì)胞，常規(guī)消化離心，吹打重懸，血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整密度至1×108/L，均勻接種至6孔培養(yǎng)板，每孔加1 ml細(xì)胞懸液，補(bǔ)充含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基至2 ml。待細(xì)胞鋪滿整個孔底后，用2 μl槍頭在單層細(xì)胞表面緩慢豎直劃出一條筆直痕跡，吸棄培養(yǎng)液，PBS小心沖洗2次，洗去殘留細(xì)胞分別加入實驗組及對照組的無血清培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0、24、48 h拍照觀察細(xì)胞的相對劃痕愈合面積(遷移前劃痕的面積-遷移后劃痕的面積)，以24 h劃痕愈合面積作為統(tǒng)計學(xué)計算標(biāo)準(zhǔn)。實驗重復(fù)3次。

圖1 不同濃度多肽對人成骨細(xì)胞黏附性能的影響

圖2 劃痕愈合實驗檢測不同濃度成骨細(xì)胞特異性識別多肽對成骨細(xì)胞遷移的影響

1.2.4Transwell遷移實驗 實驗分為6組，即對照組、10-4mol/L組、10-5mol/L組、10-6mol/L組、10-7mol/L組、10-8mol/L組。實驗前1天將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液。胰酶消化后，離心收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液清洗2次，再次離心收集用含1%血清培養(yǎng)基配置成1×105個/ml的細(xì)胞懸液，以每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于24孔，8 μm聚碳酸酯膜孔徑的transwell小室即上室里，下室按照實驗分組加入含不同濃度多肽的含30%血清培養(yǎng)液600 μl,對照組加入不含多肽的含30%血清培養(yǎng)液600 μl，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h, 72 h后取出小室,刮去上層未遷移的人成骨細(xì)胞及碎片，PBS沖洗3次, 4% 多聚甲醛固定30 min, 0.1%結(jié)晶紫染色10 min，光鏡下觀察、計數(shù)、拍照。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞黏附實驗結(jié)果不同濃度成骨細(xì)胞特異性多肽培養(yǎng)一定時間后，對成骨細(xì)胞的黏附性能有不同的影響。細(xì)胞黏附0.5 h、1 h及8 h,實驗組除10-7mol/L及10-8mol/L組外，其余各實驗組黏附細(xì)胞數(shù)目均高于對照組(P<0.05)；細(xì)胞黏附2 h及4 h，實驗組除10-8mol/L組外其余各實驗組黏附數(shù)目均高于對照組(P<0.05)。見圖1。

2.2成骨細(xì)胞特異性識別多肽對人顱骨成骨細(xì)胞遷移能力的影響

2.2.1成骨細(xì)胞劃痕修復(fù)實驗結(jié)果 實驗組各濃度組與對照組之間劃痕愈合面積的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=75.87,P<0.05)，見表1；與對照組及其余實驗組相比，10-4mol/L與10-5mol/L組細(xì)胞劃痕愈合面積均顯著增加(P<0.05)，見圖2、3。

2.2.2transwell小室實驗檢測成骨細(xì)胞遷移結(jié)果實驗組各組細(xì)胞遷移數(shù)目均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=127.999，P<0.05)，見表1。10-4mol/L組與10-6mol/L組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.25,P>0.05),其余各實驗組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、4。

表1 成骨細(xì)胞特異性識別多肽對人成骨細(xì)胞遷移作用的影響

與對照組比較：*P<0.05

圖3 不同濃度成骨細(xì)胞特異性識別多肽對成骨細(xì)胞遷移的影響

A：10-4mol/L 組；B：10-5mol/L 組；C：10-6mol/L 組；D：10-7mol/L 組；E：10-8mol/L 組

圖4 transwell小室實驗檢測不同濃度的成骨細(xì)胞特異性識別多肽對成骨細(xì)胞遷移的影響 ×50

3 討論

機(jī)體正常生長發(fā)育過程中, 細(xì)胞黏附與遷移是不可或缺的生理活動，也是組織工程中的重要現(xiàn)象，是重新構(gòu)建生成組織和器官的重要手段，而組織損傷、感染及修復(fù)離不開細(xì)胞黏附、遷移[5]。臨床上一切形式骨缺損后的骨愈合以及種植體的骨整合，均需要進(jìn)行以成骨為主的組織修復(fù)，而新骨形成主要是成骨細(xì)胞活動的結(jié)果。種植體界面的骨整合是決定種植體成功與否的關(guān)鍵，常見的界面接觸形式分為骨與種植體接觸和纖維組織與種植體接觸兩種，前者是種植成功的標(biāo)志，后者則可導(dǎo)致種植失敗。多項研究顯示成骨細(xì)胞在種植基材表面的初期黏附是一個最先發(fā)生且決定其命運(yùn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6-7]，成骨細(xì)胞無論是在體內(nèi)還是體外都必須與其所附著的材料表面發(fā)生適當(dāng)?shù)酿じ讲拍苓M(jìn)行遷移和增殖[8]。因此，如何提高成骨細(xì)胞在種植體表面黏附、遷移、聚集和增殖等成骨活性并通過對材料表面改性以提高種植基材的生物相容性是該領(lǐng)域研究的中心問題。通過材料表面的生物化修飾，從分子水平調(diào)控細(xì)胞與材料間的相互作用，誘發(fā)特異性細(xì)胞反應(yīng)，抑制非特異性反應(yīng)，實現(xiàn)細(xì)胞的黏附、遷移、增殖，甚至細(xì)胞的分化、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)成為目前研究熱點[9-10]。本實驗采用的成骨細(xì)胞特異性識別多肽是課題組通過噬菌體肽庫篩選技術(shù)所得，本課題前期體內(nèi)實驗證實：10-8～10-4mol/L濃度范圍內(nèi)的特異性多肽能夠顯著促進(jìn)人顱骨成骨細(xì)胞增殖和礦化相關(guān)蛋白表達(dá)，其中10-5mol/L濃度最為顯著，體內(nèi)實驗證實：該多肽可促進(jìn)兔顱骨缺損的骨修復(fù)[11-12]。本研究通過細(xì)胞黏附、遷移實驗，探討該多肽分子對成骨細(xì)胞成骨活性的影響，結(jié)果證實特定濃度的特異性多肽可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和遷移。

細(xì)胞黏附與遷移能力是表征細(xì)胞生物學(xué)性能的一個重要指標(biāo)，成骨細(xì)胞在種植基材表面的黏附、遷移直接關(guān)系到種植體骨愈合的質(zhì)量。本實驗通過細(xì)胞黏附、細(xì)胞劃痕和transwell小室實驗，探討特異性多肽對成骨細(xì)胞黏附、遷移的影響。結(jié)果顯示：在各個時間段(0.5、1、2、4、8 h)，該特異性多肽在10-6～10-4mol/L濃度均能促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附，其中10-5mol/L濃度的黏附促進(jìn)作用最為顯著，且與其他實驗組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。劃痕愈合及transwell小室實驗顯示10-8～10-4mol/L濃度范圍的特異性識別多肽與對照組相比均對成骨細(xì)胞遷移有不同程度的促進(jìn)作用，其中10-5mol/L及10-4mol/L促進(jìn)遷移作用較為顯著。綜上所述，成骨細(xì)胞特異性識別多肽能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附與遷移，且10-5mol/L濃度促進(jìn)人顱骨成骨細(xì)胞黏附與遷移作用最為顯著。

在采用劃痕愈合及transwell小室定時定量監(jiān)測細(xì)胞遷移的實驗中，早期(即24 h)即可觀察到明顯劃痕愈合的現(xiàn)象，而transwell小室實驗在以10%血清作為趨化條件下，各個時間段(24、48、72 h)均未見細(xì)胞穿過小室底，而后實驗調(diào)整為以30%血清作為趨化條件，72 h后小室底可見理想的細(xì)胞遷移數(shù)目。細(xì)胞遷移涉及到細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附相關(guān)的動態(tài)組裝和空間位置的改變，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的骨架結(jié)構(gòu)是細(xì)胞移行的基礎(chǔ), 而分布在細(xì)胞表面的趨化因子受體及黏附分子則能夠使細(xì)胞對周圍環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)或其他細(xì)胞做出反應(yīng)[13]，而劃痕實驗及transwell小室實驗?zāi)芊窈芎玫啬M細(xì)胞的這種活動可能取決于所研究細(xì)胞系的特點。成骨細(xì)胞系在病理狀態(tài)下如組織損傷、感染及修復(fù)時細(xì)胞遷移可能以側(cè)向運(yùn)動為主，所以劃痕愈合實驗?zāi)軌蚝芎玫啬M這種運(yùn)動形式，而transwell小室實驗需要在合適的趨化條件和時間下才能達(dá)到理想的效果。上述推論尚待進(jìn)一步研究證實。