王 健，潘亞萍，徐元宏，沈繼錄，王中新

碳青霉烯類抗生素對大多數(shù)革蘭陽性、陰性需氧菌、厭氧菌及多重耐藥菌均有較強的抗菌活性，已成為臨床對抗耐藥菌株有力的武器。2001年首次報道了一株碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)[1],該株細菌能對包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。隨后不久，世界各地均有CRKP菌株被報道的案例出現(xiàn)[2-3]。

肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性是目前全球性關(guān)注的熱點問題[4-5]。產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的耐藥機制，目前研究[6]肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥主要系產(chǎn)生KPC型碳青霉烯酶。該研究對臨床分離的31株CRKP的耐藥表型和耐藥基因進行檢測分析以及外排泵抑制劑對CRKP的作用進行探究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 31株CRKP來源于醫(yī)院臨床分離菌，經(jīng)法國梅里埃公司Vitek2全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，對碳青酶烯類均耐藥。

1.1.2主要儀器和試劑 GeneAmp970基因擴增儀(美國PE公司)；C-880V CO2孵箱、蛋白電泳分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(中國heal force公司)；抗菌藥物(美國BBL公司、英國OXOID公司)；藥敏試驗培養(yǎng)基為Muller-Hinton瓊脂；外排泵抑制劑(Phe-Arg-β-naphthylamide，PAβN)(美國Sigma公司)；標志物DL 2 000、Ex Taq DNA聚合酶試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；瓊脂糖、引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1藥敏實驗及細菌鑒定 采用CLSI 2014版推薦的紙片擴散法和Vitek2法進行藥敏試驗并判讀結(jié)果，細菌鑒定采用全自動微生物鑒定。最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)測定按CLSI2010版推薦的瓊脂稀釋法進行。亞胺培南和美羅培南濃度范圍為128～0.06 mg/L。細菌接種菌量為104CFU/點。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC BAA1705/ATCC BAA1706)。

1.2.2碳青霉烯酶的篩選

1.2.2.1Carba-NP試驗 A液配制：取25～50 ml燒杯，將2 ml 0.5%酚紅溶液加入到16.6 ml純水中，加入180 ml 10 mmol/L硫酸鋅溶液，使用0.1 N氫氧化鈉溶液(或10%鹽酸溶液)調(diào)整pH值為(7.8±0.1)。B液配制：A液+6 mg/ml亞胺培南。步驟：標記兩個微量離心管分別為a、b，每管中加入100 μl 細菌蛋白抽提液(美國Thermo Scientific公司)，1 μl接種環(huán)待測物(從過夜的血平板上刮取)，渦旋震蕩器上劇烈震蕩5 s后，a管中加入100 μl A液，b管中加入100 μl B液，渦旋振蕩混勻，35 ℃溫箱孵育2 h觀察結(jié)果(每30 min觀察一次顏色變化)。

1.2.2.2改良Hodge試驗 按CLSI 2012推薦的方法進行，將0.5麥氏濁度單位的大腸埃希菌ATCC25922稀釋10倍后涂布于M-H平板，中間貼厄他培南(10 μg)紙片，接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣劃線接種待檢菌，注意不要劃破平板表面。35 ℃過夜培養(yǎng)，次日，厄他培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長者為待檢菌產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.2.3PCR擴增KPC、ESBL和AmpC酶基因 提取并純化細菌基因組DNA作為擴增模板，KPC、NDM-1、ESBL和AmpC酶基因。產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下成像分析結(jié)果。擴增產(chǎn)物測序均由上海生工公司完成。獲得序列與GenBank中序列進行比對，以證實擴增產(chǎn)物為目的基因片段和確定基因型。

1.3外排泵的抑制試驗在采用瓊脂稀釋法測定亞胺培南單藥MIC的同時另設(shè)一組加入泵抑制劑PAβN(終濃度20 mg/L)的亞胺培南的試驗組。亞胺培南的濃度范圍為128～0.06 mg/L。外排泵表型檢測結(jié)果的判斷以添加和不添加PAβN時MIC值降低4倍或4倍以上者可推斷認為該菌具有外排泵機制。

1.4ERIC-PCR同源性分析引物序列：ERIC1: ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC；ERIC2：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。擴增條件如下：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，2 ℃延伸1 min，共20個循環(huán)，隨后94 ℃變性1 min, 42 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳(100 V，100 min，0.5×TBE)。

1.5統(tǒng)計學處理使用WHONET 5.6軟件對紙片法的抑菌圈直徑藥敏結(jié)果和儀器法MIC藥敏結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗結(jié)果所有菌株對碳青霉烯類耐藥率為100%，對頭孢菌素類、氨基糖苷類和喹諾酮類耐藥率均高于80%，而四環(huán)素類抗生素耐藥率在20%左右，見圖1。

2.2碳青霉烯酶檢測結(jié)果結(jié)果顯示有29株CRKP的Carba-NP試驗和改良Hodge試驗均為陽性，陽性率93.5%，24號株Carba-NP試驗陽性而改良Hodge試驗陰性，6號株Carba-NP試驗和改良Hodge試驗均為陰性。

2.3耐藥基因檢測結(jié)果PCR結(jié)果顯示KPC酶基因檢出率為87.1%，均為KPC-2型，NDM-1的檢出率為71.0%；ESBLs本次檢測的耐藥基因中blaCTX-M、blaSHV和blaTEM陽性率分別為61.3%、96.8%和77.4%；質(zhì)粒介導的AmpC酶檢測出DHA、CTT、FOX酶基因，陽性率分別為100%、61.3%、87.1%。未檢出SME、OXA-48、GES、VIM、IMP、VEB、AAC、EBC、MOX。

2.4外排泵的抑制試驗結(jié)果泵抑制劑PAβN和亞胺培南、美羅培南和替加環(huán)素協(xié)同試驗的結(jié)果顯示有3株對亞胺培南和美羅培南的MIC分別下降了4倍和8倍，而替加環(huán)素卻未下降。

2.5ERIC-PCR基因分型31株CRKP主要分為9型，其中1型13株，4型和5型各5株，6型和8型各2株，2、3、9型各1株。見圖2。

圖1 31株CRKP對常見抗生素的耐藥率和敏感率

AMP：氨芐西林；PRL：哌拉西林；SCF：頭孢哌酮/舒巴坦；SAM：氨芐西林/舒巴坦；TZP：哌拉西林/他唑巴坦；CZO：頭孢唑啉；CXM：頭孢呋辛；CAZ：頭孢他啶；CRO：頭孢曲松；CTX：頭孢噻肟；FEP：頭孢吡肟；CTT：頭孢替坦；ATM：氨曲南；IMP：亞胺培南；MEM：美羅培南；AMK：阿米卡星；GEN：慶大霉素；TOB：妥布霉素；CIP：環(huán)丙沙星；LVX：左旋氧氟沙星；SXT：復方新諾明；FOS：磷霉素；NIT：呋喃妥因；MH：米諾環(huán)素；TGC：替加環(huán)素

圖2 部分臨床菌株ERIC-PCR基因分型圖譜

M：Marker；1、2、4、6、7:1型；3：2型；5：3型；8、9、10、14:4型；11、12、13、15:5型；16:6型

3 討論

碳青霉烯類對質(zhì)粒介導的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、染色體及質(zhì)粒介導的頭孢菌素酶(AmpC酶)均具有高度穩(wěn)定性，但可被碳青霉烯酶水解滅活，造成碳青酶烯類抗生素耐藥。隨著臨床應用的不斷增加，產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染持續(xù)增多，我國克雷伯菌屬細菌對碳青霉烯類藥物耐藥率呈逐年上升趨勢，形勢不容樂觀[7]。本研究中篩選的31株CRKP，同時對青霉素類、頭孢菌素、氨曲南等其他β內(nèi)酰胺類抗菌藥物也表現(xiàn)出高度耐藥，而對四環(huán)素類耐藥率較低。數(shù)據(jù)表明本院分離的CRKP多為高水平耐藥的多重耐藥菌，而有效抗生素范圍很窄，這對本院臨床治療感染帶來嚴重挑戰(zhàn)，前景令人擔憂。

革蘭陰性菌對碳青霉烯類的耐藥機制，最突出的是碳青霉烯酶的產(chǎn)生[8]，其他的還有高產(chǎn)AmpC酶伴外膜孔蛋白的丟失、靶位點的改變和主動泵出系統(tǒng)的過量表達。目前常見的碳青霉烯酶主要有KPC、IMP、VIM、NDM等，國內(nèi)以KPC和IMP為主[9]。Carba-NP試驗和改良Hodge試驗是CLSI推薦的碳青霉烯酶表型檢測方法。本研究中所有產(chǎn)KPC菌Carba-NP 試驗和改良Hodge試驗均陽性，表明Carba-NP 試驗和改良Hodge試驗檢測KPC型碳青霉烯酶有較高的靈敏度，可用于對疑是產(chǎn)碳青霉烯酶細菌進行表型初篩試驗。31株CRKP有4株KPC基因檢測陰性，其中3株均攜帶NDM-1基因，NDM-1可水解碳青霉烯類抗生素，剩下的6號株Carba-NP試驗和改良Hodge試驗均為陰性，KPC基因和NDM-1基因檢測也陰性，而膜孔蛋白OmpK35/36均未缺失，可能由于細菌產(chǎn)ESBLs酶出現(xiàn)假陽性結(jié)果[10]或其他耐藥機制。

本研究中KPC型碳青霉烯酶均為KPC-2型，檢出率87.1%。KPC-2酶能單獨引起碳青霉烯類耐藥，不依賴于膜孔蛋白的丟失，基因由可轉(zhuǎn)移的70 kb質(zhì)粒編碼，位于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子上，具有高傳播可能。2009年，英國卡迪夫大學的研究團隊在肺炎克雷伯桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶，即NDM酶，該酶可以水解除氨曲南以外的所有β-內(nèi)酰胺類藥物，包括碳青霉烯類抗生素，其最常見NDM-1型，在我國NDM-1檢出率逐年上升[11]。本院CRKP中NDM-1型檢出率較高，為71.0%，加大了臨床治療CRKP感染的難度，因此院感科要引起重視。我國ESBLs流行的種類以CTX型和SHV型為主[12]，本院流行耐藥基因型與國內(nèi)報道基本一致。本研究AmpC酶陽性率為100%，主要為DHA型和FOX型。所有菌株未檢出 EBC、ACC和MOX酶基因。耐藥基因檢測結(jié)果顯示，26株菌同時攜帶KPC、ESBL、AmpC三種酶基因，說明CRKP存在多種耐藥基因積聚共存現(xiàn)象。Ogbolu et al[13]認為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細菌往往同時攜帶其他種類抗菌藥物的耐藥基因。耐藥細菌通過產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶基因以及質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移導致耐藥性播散及拓寬耐藥譜，可能是導致菌株耐藥性更強、耐藥譜更廣的原因。

外排泵系統(tǒng)的表達是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥性的重要機制[14]。細菌的外排泵系統(tǒng)包括：耐藥結(jié)節(jié)化細胞分化家族、ATP結(jié)合盒家族、主要易化子超家族、小多重耐藥家族和多藥及毒性化合物外排家族。通過外排泵表型抑制試驗，結(jié)果顯示3株細菌對亞胺培南和美羅培南的MIC分別下降了4倍和8倍，可能是外排泵機制導致的耐藥。Filgona et al[15]也發(fā)現(xiàn)外排泵抑制劑可以降低CRKP對厄他培南、多尼培南的MIC值。Seecoomar et al[16]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌中ArcAB外排泵與β-內(nèi)酰胺類耐藥有關(guān)。

本研究中31株CRKP的基因分型顯示有9種類型，其中1型13株，為主要流行株，表明我院可能存在1型克隆株的播散流行，由于CRKP耐藥嚴重，易發(fā)生流行，因此要嚴格控制抗菌藥物的使用，加強院內(nèi)感染的防控措施。其次為4型和5型各5株，6型和8型各2株，2、3、9型各1株。

CRKP通常合并其他抗生素耐藥，發(fā)展為多重耐藥菌，有效治療藥物有限，給臨床治療帶來了極大的困擾。我院肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶為KPC-2型酶，且常常合并產(chǎn)生ESBLs酶和AmpC酶，形成耐藥基因的積聚共存現(xiàn)象，導致細菌的多重耐藥。外排泵的表達可能參與肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，其關(guān)系有待進一步研究。同時臨床應加強醫(yī)院感染控制及用藥管理，避免耐亞胺培南肺炎克雷伯菌傳播擴散。