劉瑞雪，魯桓兵，宋育林

結(jié)核病目前仍然是全球?yàn)?zāi)難性疾病之一，在結(jié)核病臨床防治過(guò)程中，異煙肼(isoniazid，INH)是一線抗結(jié)核藥；異煙肼的使用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，主要是抗結(jié)核藥物性肝損傷(antituberculosis drug-induced liver injury，ADLI)，嚴(yán)重者可使治療中斷或失敗，甚至造成肝衰竭或死亡[1]。異煙肼所致肝損傷涉及多種機(jī)制，可能與代謝產(chǎn)物的直接毒性作用、基因多態(tài)性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能障礙、免疫反應(yīng)、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體異常等因素相關(guān)[2]，確切機(jī)制目前仍不明確。AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]參與多種機(jī)制調(diào)節(jié)，在脂質(zhì)代謝上，AMPK通過(guò)調(diào)節(jié)自身磷酸化參與脂質(zhì)合成和分解代謝，磷酸化AMPK通過(guò)修飾乙酰輔酶羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)磷酸化而抑制酶的活性，抑制脂肪酸合成，減少脂質(zhì)積累[3]。Foretz et al[4]研究證明AMPK磷酸化可抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)，引起脂肪酸合成減少。異煙肼所致肝損傷的病理表現(xiàn)有脂肪變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等。該研究通過(guò)建立異煙肼所致肝損傷大鼠模型，探討AMPK磷酸化在異煙肼所致肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 健康SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.1.2藥品與試劑 異煙肼購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；生理鹽水購(gòu)自中國(guó)大冢制藥公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；肝組織TG試劑盒購(gòu)自北京普利來(lái)公司；AMPK、p-AMPK、p-ACC一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；FAS、GAPDH一抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.3主要儀器 DPP全自動(dòng)生化分析儀(瑞士RocheModular公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、異煙肼低劑量組、異煙肼高劑量組，每組8只。所有大鼠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度 (20±2)℃，室內(nèi)濕度保持在 50%～70 %，晝夜節(jié)律保持 12 h 光照與 12 h 黑暗交替。每3 d稱重一次，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2.2給藥 參考文獻(xiàn)[5]方法及本課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，異煙肼組給予 50 mg/(kg·d)異煙肼及100 mg/(kg·d)，正常對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，均每日定時(shí)灌胃一次，共2周。

1.2.3取材 給藥2周后處死大鼠。取材前禁食、水12 h， 水合氯醛300 mg/kg麻醉后腹主動(dòng)脈采血，收集血清，留取肝左葉，用10%福爾馬林緩沖液固定，余肝臟組織凍存于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。

1.3觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1肝指數(shù)測(cè)定及形態(tài)學(xué)觀察 稱重后處死大鼠，低溫下完整迅速取肝，稱重，計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝重/體重)，取部分肝左葉組織，10%中性福爾馬林組織液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片及HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3.2血清肝功能指標(biāo) 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及總膽汁酸(total bile acid，TBA)水平。

1.3.3血清血脂指標(biāo) 使用試劑盒于酶標(biāo)儀測(cè)定大鼠血清TG、TC水平。

1.3.4肝組織血脂指標(biāo) 使用試劑盒于酶標(biāo)儀測(cè)定大鼠肝臟組織TG水平。

1.3.5肝臟組織p-ACC免疫組織化學(xué)染色 按照VP-6001二步法免疫組織化學(xué)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，一抗?jié)舛葹? ∶400，用PBS代替一抗作為陰性參照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片。陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，每例在光鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野取5個(gè)視場(chǎng)，每個(gè)視場(chǎng)面積為268 μm2，采用Image plus 6.0高清晰圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析切片，測(cè)定肝組織p-ACC染色的平均光密度(optical density，OD)值。

1.3.6Western blot測(cè)定 AMPK、p-AMPK、FAS蛋白表達(dá) 提取大鼠肝蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加AMPK及p-AMPK(1 ∶1 000)、FAS(1∶100)、DAPDH(1∶200)一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，相應(yīng)的二抗(1∶5 000)室溫孵育，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)熒光信號(hào)。采用Image J高清晰圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測(cè)定肝組織p-AMPK、AMPK、FAS、GAPDH表達(dá)的灰度值。

2 結(jié)果

2.1一般情況與正常對(duì)照組比較，異煙肼組大鼠毛發(fā)光澤減弱，尤以高劑量組明顯，活動(dòng)度一般，體重增長(zhǎng)幅度較小。與正常對(duì)照組比較，異煙肼組在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)第6天體重增加幅度下降。異煙肼組大鼠在實(shí)驗(yàn)第6天(F=4.259，P<0.05)、第9天(F=4.782，P<0.05)、第12天(F=4.882，P<0.05)及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(F=6.281，P<0.001)低于正常對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體重增長(zhǎng)曲線

2.2肝指數(shù)異煙肼低劑量組、異煙肼高劑量組大鼠肝指數(shù)分別為(0.032±0.002)和(0.037±0.001)，均較正常對(duì)照組肝指數(shù)(0.031±0.001)增加，且異煙肼高劑量組與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.444，P<0.01)。

2.3血清肝生化變化異煙肼高劑量組ALT、AST分別較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。異煙肼高劑量組血清TG較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4肝組織TG生化變化異煙肼高劑量組肝組織TG為(16.674±1.697)mg/g 肝重量，高于正常對(duì)照組(12.015±1.739 )mg/g 肝重量和異煙肼低劑量組(13.815±2.298)mg/g 肝重量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.845,P<0.001)。

2.5肝臟病理學(xué)改變光鏡下，正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小及形態(tài)正常。異煙肼組大鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)脂肪變性，部分存在點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中異煙肼高劑量脂肪變性更明顯。見(jiàn)圖 2。

2.6肝臟p-ACC表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞質(zhì)中有p-ACC表達(dá)的黃色顆粒。與正常對(duì)照組比較，異煙肼組p-ACC表達(dá)的強(qiáng)度和范圍減少，且異煙肼高劑量組更明顯。與正常對(duì)照組OD值(0.226±0.023)比較，異煙肼低劑量組(0.187±0.008)和異煙肼高劑量組(0.180±0.008)p-ACC的OD值均明顯低于正常對(duì)照組(F=10.932，P<0.001)。見(jiàn)圖3。

2.7肝組織AMPK及p-AMPK、FAS蛋白表達(dá)情況與正常對(duì)照組比較，異煙肼組AMPK表達(dá)均無(wú)明顯差異。低劑量、高劑量異煙肼組p-AMPK/AMPK灰度比值分別為(0.164±0.004)、(0.155±0.004)，均低于正常對(duì)照組(0.880±0.015)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5 715.645，P<0.001)，提示表達(dá)明顯減少。異煙肼低劑量、高劑量組FAS灰度分別為(0.639±0.038)、(1.230±0.044)，高于正常對(duì)照組 (0.187±0.007)，提示表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=718.268，P<0.001)。見(jiàn)圖4。

表1 各組大鼠肝指數(shù)及血清生化指標(biāo)

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 HE×400

圖3 各組大鼠肝臟p-ACC的表達(dá)情況 免疫組化×400

圖4 Western blot法檢測(cè)肝組織AMPK、p-AMPK和FAS表達(dá)情況

A：p-AMPK表達(dá)；B：FAS表達(dá)；1：正常對(duì)照組；2：異煙肼低劑量組；3：異煙肼高劑量組；與正常對(duì)照組比較：***P<0.001

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異煙肼處理2周可導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞脂肪變性，部分存在點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致。結(jié)果顯示，異煙肼組的大鼠血清ALT、AST高于正常對(duì)照組，異煙肼組的肝形態(tài)學(xué)改變，且高劑量組表現(xiàn)嚴(yán)重，表明本研究建立異煙肼致肝損傷模型成功。本研究中，肝臟組織及血清中TG含量均增加，且高劑量組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示異煙肼可引起肝細(xì)胞內(nèi)TG含量增加造成肝細(xì)胞脂肪變性。

肝細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生與脂肪酸的攝取、合成及氧化障礙有關(guān)。AMPK是一種應(yīng)激敏感性激酶，激活A(yù)MPK可通過(guò)促進(jìn)糖酵解和脂肪酸氧化；引起ACC磷酸化增加，抑制ACC活性；抑制FAS表達(dá)減少，引起脂肪酸合成減少[3-4,6-8]；還可通過(guò)上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα) 來(lái)促進(jìn)脂肪分解[9]。因而，在肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究[6-8]表明，AMPK磷酸化的抑制參與了非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝的發(fā)病過(guò)程。研究[10]顯示，給予AMPK敲除的小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，第5周時(shí)即出現(xiàn)肝脂肪變，血糖升高及胰島素抵抗；而正常組小鼠第12周時(shí)才出現(xiàn)肝脂肪變。本研究結(jié)果顯示，異煙肼處理2周后大鼠肝臟AMPK磷酸化水平顯著下降，伴隨著ACC磷酸化水平的減低，即ACC活性增加和FAS表達(dá)的增加，提示AMPK磷酸化下降及其下游參與脂肪酸合成的ACC及FAS增加參與了異煙肼所致的大鼠肝損傷的病理過(guò)程。

AMPK是一種重要的能量穩(wěn)態(tài)傳感器，參與細(xì)胞能量水平和代謝壓力的調(diào)節(jié)，具有較為復(fù)雜的活性調(diào)節(jié)機(jī)制，在肝組織中，AMPKα1為最常見(jiàn)的催化亞基，受TGF-β活化激酶-1、肝激酶B1以及鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(calmodulin- dependent protein kinasekinase，CaMKK)3種激酶調(diào)節(jié)，負(fù)責(zé)活化磷酸化基團(tuán)，生理AMP/ADP增加的細(xì)胞應(yīng)激，如低氧、饑餓或葡萄糖剝奪，也可激活A(yù)MPK磷酸化[6,11]。異煙肼抑制肝臟AMPK磷酸化的可能機(jī)制：① 異煙肼在體內(nèi)代謝為乙酰肼和肼，異煙肼在肝內(nèi)經(jīng)P-450還原后，產(chǎn)生親電子基、自由基、氧基等毒性代謝產(chǎn)物，破壞肝細(xì)胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境Ca2+的穩(wěn)態(tài)被破壞，肝化學(xué)毒性損害時(shí)通過(guò)Ca2+濃度下降并抑制相關(guān)酶形成，如AMPK磷酸化上游激酶，CaMKK-β，抑制AMPK磷酸化[10,12-13]；② SIRT1-AMPK通路的抑制作用：前期研究[14]顯示，異煙肼和利福平合用減少肝臟SIRT1表達(dá)。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，激活SIRT1/AMPK通路可以減輕肝損傷，提示異煙肼可能會(huì)通過(guò)SIRT1/AMPK通路抑制AMPK磷酸化，但確切機(jī)制尚有待探討。

本研究表明，異煙肼可通過(guò)抑制AMPK磷酸化，抑制ACC磷酸化，上調(diào)FAS表達(dá)，造成肝細(xì)胞內(nèi)TG沉積，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性。提示AMPK磷酸化有可能成為防治異煙肼所致肝損傷的脂肪變性的一個(gè)治療靶點(diǎn)。