王培宇，梁前俊，張 力,2，樊 松,2，梁朝朝,2

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，隨著前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)篩查的普及，更多的患者被早期檢出。然而一部分患者就診時已經(jīng)為臨床晚期，治療方法上常采用內(nèi)分泌聯(lián)合放療或根治性手術(shù)[1]。自噬是細胞內(nèi)溶酶體降解過程，在細胞生長、分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，參與細胞器的更新和細胞正常代謝。糖皮質(zhì)激素可以誘導骨細胞的自噬[2]，也可以降低去勢抵抗型前列腺癌患者的PSA水平，其中地塞米松(dexamethasone，Dex)可能是單一療法中效果最好的糖皮質(zhì)激素[3]。目前糖皮質(zhì)激素對前列腺癌自噬的影響尚不十分清楚，該研究使用不同濃度的糖皮質(zhì)激素Dex處理激素非依賴性前列腺癌PC3細胞，觀察自噬過程的變化，并通過自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)來探討自噬對Dex作用下前列腺癌PC3細胞的影響，為晚期激素非依賴性前列腺癌患者的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料和儀器前列腺癌PC3細胞來自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所；Dex購自山東辰欣藥業(yè)股份有限公司；CQ購自美國Selleck公司；LC3質(zhì)粒標記綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(greenefluorescent-LC3,GFP-LC3)和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogeng公司；MTT購自美國Solarbio公司；兔抗LC-3抗體、鼠抗GAPDH抗體、兔鼠二抗購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備公司；高速冷凍離心機購自美國Thermo公司； Chemiscope 5600 化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學儀器有限公司;ELx800酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1MTT實驗 PC3細胞培養(yǎng)在1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和0.1%青霉素、鏈霉素。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中生長。細胞接種于96孔板，細胞貼壁24 h后分別以Dex(0、500、750、1 000 μmol/L)以及50 μmol/L CQ處理24 h，然后每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，作用4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，溶解后490 nm下測定吸光度值。

1.2.2Western blot法檢測 不同濃度Dex(0、500、750、1 000 μmol/L)和50 μmol/L CQ處理前列腺癌PC3細胞24 h后，冰上裂解20 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液加上樣緩沖液煮沸10 min,以15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將LC3蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。5%的脫脂奶粉緩慢搖晃封閉2 h。1 ∶1 000稀釋LC3一抗后4 ℃孵育過夜。然后用TBST洗膜40 min，室溫下孵育二抗1 h,加ECL試劑后顯影。

1.2.3免疫熒光法 取對數(shù)生長期的PC3傳代至細胞培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后按說明書將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染GFP-LC3到PC3細胞后，以不同濃度Dex和CQ處理24 h，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)點狀聚集情況。

2 結(jié)果

2.1Dex對前列腺癌PC3細胞的增殖的影響與對照組比較，濃度為 500、750、1 000 μmol/L的Dex處理前列腺癌PC3細胞24 h后，MTT法測得細胞存活率相對百分比分別為(81.66%±3.47%)、(77.78%±1.15%)、(72.44%±3.42%)，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.16、33.36、13.97，P<0.01)。與對照組比較，濃度為50 μmol/L CQ處理前列腺癌PC3細胞24 h后，細胞存活率相對百分比為(98.81%±0.82%),差異無統(tǒng)計學意義(t=2.52，P>0.05)。與不加CQ的Dex組比較，濃度為500、750、1 000 μmol/L Dex和50 μmol/L CQ共同處理細胞24 h后，細胞存活率相對百分比分別為(71.19%±2.10%)、(68.84%±3.08%)、(63.56%±3.41%)，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.47、4.71、3.19，P<0.05)。見圖1。

圖1 前列腺癌PC3細胞經(jīng)Dex處理后細胞存活率

與對照組比較：*P<0.01；與同濃度Dex比較：#P<0.05

2.2Dex對前列腺癌PC3細胞自噬蛋白表達的影響CQ是一種自噬抑制劑，可以升高溶酶體pH，抑制溶酶體自噬體的融合和溶酶體蛋白降解，提高LC3Ⅱ型蛋白的積累。Western blot結(jié)果顯示，在Dex作用于PC3細胞24 h后，可以觀察到LC3Ⅱ型蛋白表達增加，說明Dex誘導了前列腺癌PC3細胞的自噬效應。隨著濃度的增加，這種自噬效應更加明顯。CQ抑制了PC3細胞的自噬效應，也抑制了Dex誘導的自噬，見圖2。

2.3Dex對前列腺癌PC3細胞自噬的影響當自噬形成時，GFP-LC3 融合蛋白會轉(zhuǎn)位到自噬體膜上，在熒光顯微鏡下可以觀察到多個明亮的綠色熒光斑點。本實驗通過觀察前列腺癌PC3細胞中自噬小體GFP-LC3點狀聚集的程度來評估細胞自噬水平。Dex處理24 h后，熒光顯微鏡下觀察到Dex作用后的前列腺癌細胞內(nèi)GFP-LC3點狀聚集程度較對照組增加。隨著Dex的濃度增加，GFP-LC3點狀聚集程度增加，說明Dex濃度越高，誘導自噬效應越強。CQ可以抑制前列腺癌PC3細胞的自噬，并且可以抑制Dex誘導的自噬，見圖3。

圖2 Western blot法檢測前列腺癌PC3細胞自噬蛋白LC3的表達

A：對照組；B：Dex 500 μmol/L；C: Dex 750 μmol/L；D：Dex 1 000 μmol/L；E：Dex 1 000 μmol/L+CQ 50 μmol/L；F：CQ 50 μmol/L

圖3 熒光顯微鏡下觀察前列腺癌PC3細胞中點狀GFP-LC3 ×400

A：對照組；B：Dex 500 μmol/L；C: Dex 750 μmol/L；D：Dex 1 000 μmol/L；E：Dex 1 000 μmol/L+CQ 50 μmol/L；F：CQ 50 μmol/L

3 討論

非激素依賴性前列腺癌對于常規(guī)細胞毒性藥物敏感性差，如何延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量，是研究熱點之一。糖皮質(zhì)激素可以減緩疾病進展，改善疼痛，降低化療的副作用，已經(jīng)用于前列腺癌的藥物治療[4]。近些年，節(jié)拍化療在緩解和維持治療轉(zhuǎn)移性非激素依賴性前列腺癌展現(xiàn)出非常有潛力的治療價值。節(jié)拍化療具有安全、低毒性的優(yōu)點，尤其適用于老年、體弱的非激素依賴性前列腺癌患者。其治療方法多樣，包括單一應用化療藥物，化療藥物聯(lián)合皮質(zhì)醇類藥物以及多種化療藥物聯(lián)合應用。糖皮質(zhì)激素聯(lián)合化療藥物的節(jié)拍化療方案多為Ⅱ期臨床研究，Nelius et al[5]研究了17例多西他賽耐藥的非激素依賴性前列腺癌患者，每日口服Dex 1 mg和環(huán)磷酰胺50 mg，直到疾病進展或不能耐受的副作用。9例患者治療后PSA下降，總生存期為24個月。Fontana et al[6]研究了28例激素非依賴性前列腺癌患者，其中68%為多西他賽耐藥患者。第1天，患者接受500 mg/m2環(huán)磷酰胺靜滴治療，從第2天開始，每天口服50 mg環(huán)磷酰胺聯(lián)合400 mg塞來昔布和1 mg Dex直到疾病進展。結(jié)果9例(32%)治療后PSA下降超過50%。中位無進展生存期和總生存期分別為3個月和21個月。

糖皮質(zhì)激素對前列腺癌的具體作用機制目前尚不十分清楚。糖皮質(zhì)激素通過負反饋抑制下丘腦、垂體軸，抑制睪丸和腎上腺雄激素的合成，延緩前列腺癌進展[7]。糖皮質(zhì)激素也可以通過糖皮質(zhì)激素受體依賴的方式調(diào)節(jié)細胞因子，進而抑制前列腺癌細胞的生長。通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β及其受體，抑制核因子κB(nuclear factor -κB，NF-κB)信號的傳導，抑制前列腺癌細胞增殖[8]。糖皮質(zhì)激素可以抑制單核細胞白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達和分泌，而IL-6參與前列腺癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲[9]，通過結(jié)合其亞基gp130激活mTOR信號通路，阻止ULK 1的活化，抑制自噬小體形成， mTOR抑制劑可以減少腫瘤的血管生成和細胞增殖，因此，糖皮質(zhì)激素可能通過抑制IL-6的分泌來達到抑制腫瘤的作用。國內(nèi)有學者認為Dex阻滯前列腺癌DU145細胞周期于G0 / G1期，可能與其抑制了ERK1 / 2 信號通路活性以及cyclin D1 蛋白表達有關(guān)[10]。Dex抑制前列腺癌PC3細胞的機制，可能是其抑制了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，并且抑制其下游的靶基因cyclinD1蛋白的表達[11]。

自噬是真核生物兩種主要的降解途徑之一，參與細胞的生長、增殖、分化和凋亡。在自噬過程中，一些細胞質(zhì)和細胞器被自噬囊泡包被，然后遞送至溶酶體進行降解。自噬是把雙刃劍，可以去除氧化損傷的細胞器來保護細胞免受凋亡，但過度自噬也會損害細胞器。因此，自噬既可以保護細胞器和細胞成分免受氧化損傷，也可以是一個自毀的過程，導致細胞死亡[12]。自噬水平關(guān)系著細胞器的合成、降解、以及再循環(huán)利用之間的平衡[13]。Tan et al[14]評估了3種人類腫瘤細胞系(MCF7、PC3和LNCaP)對低氧的敏感性，發(fā)現(xiàn)自噬有助于腫瘤對抗低氧環(huán)境，因為低氧和抗癌治療的抗性有關(guān)，抑制自噬可能有助于提高腫瘤的治療效果。Kim et al[15]發(fā)現(xiàn)聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶可以誘導前列腺癌CWR22Rv1自噬和死亡，在抑制自噬后，細胞死亡增多。PC3細胞是雄激素非依賴性前列腺癌細胞，本實驗通過檢測自噬熒光蛋白GFP-LC3和自噬相關(guān)蛋白LC3的表達水平來觀察自噬，結(jié)果顯示Dex作用后自噬熒光蛋白GFP-LC3點狀聚集增多，LC3-Ⅱ型蛋白表達增加，綜合以上結(jié)果，Dex誘導了前列腺癌細胞PC3自噬。同時，本實驗顯示Dex具有抑制前列腺癌PC3細胞存活作用，在抑制了自噬效應后，Dex抑制前列腺癌PC3細胞存活作用增強，提示了Dex誘導的自噬對前列腺癌PC3細胞是保護性的，CQ作為自噬抑制劑，體現(xiàn)出在增強抗腫瘤藥物療效方面的潛在價值。