梁 鑫, 潘秀頡, 李雪萍,3, 孫澤文,4, 楊陟華, 顧永清,5, 朱茂祥,5

電離輻射誘發(fā)的放射性肺纖維化(radiation-induced pulmonary fibrosis, RPF)是胸部腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，成纖維細(xì)胞是肺纖維化中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，有研究[1]顯示受損的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ, AECⅡ)能通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial mesenchymal transition, EMT)的方式間接轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞。EMT是指完全分化的上皮細(xì)胞失去極性、細(xì)胞間的黏附等上皮細(xì)胞的特征，獲得遷移、分化等間質(zhì)細(xì)胞特征，轉(zhuǎn)化成完全分化的間質(zhì)細(xì)胞的過程[2]。EMT在胚胎的形成與發(fā)育、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，以及組織愈合和器官纖維化等生理和病理過程中起著重要的作用[3]。然而電離輻射誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制，及EMT在RPF發(fā)生中的作用尚不清楚。該研究首先對小鼠AECⅡ進(jìn)行了分離、純化及鑒定，確定提純方法后，采用60Coγ射線照射小鼠提取AECⅡ，檢測其EMT發(fā)生情況。隨后γ射線照射幾種人源的上皮細(xì)胞系并檢測EMT發(fā)生情況，從而為進(jìn)一步研究電離輻射誘導(dǎo)的EMT在RPF發(fā)生中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及細(xì)胞 SPF級雄性C57BL/6小鼠，12只，8周齡，購自北京維通利華生物科技有限公司，動物許可證號：SCKK(京)2012-0001，完全隨機(jī)分為對照組(0 Gy)和照射組(20 Gy)，飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心。A549細(xì)胞、Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞均為本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibico公司)；表面活性蛋白C(prosurfactant protein C，SPC)抗體(ab40879)、緊密連接蛋白ZO-1(tight junction protein ZO-1，ZO-1)抗體(ab150266)(美國abcam公司)；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(562526)(美國BD Pharmingen公司)；N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(17-3259，美國Ebioscience公司)；PE標(biāo)記的羊抗兔抗體(GM200G-40C，天津三箭公司)。

1.2方法

圖1 小鼠AECⅡ的分離與純化

1.2.1小鼠AECⅡ的分離與純化 小鼠經(jīng)脫頸處死后于75%乙醇中浸泡5 min，在超凈臺中取下完整肺組織，PBS漂洗至上清液清亮；移肺入無菌50 ml離心管，剪成 1 mm3大小，按 2 ml/只小鼠加入 0.1% 的胰酶 37 ℃孵育 10 min，用等量的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化；4 ℃、1 500 r/min離心5 min，去除上清液后按 2 ml/只小鼠加入0.1% 膠原酶吹打混勻，37 ℃孵育15 min后4 ℃、3 000 r/min，離心5 min，培養(yǎng)液重懸后于200目篩網(wǎng)過濾，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，離心重懸后取出一部分細(xì)胞待測，之后通過800 r/min離心2次，每次5 min、40 μm篩網(wǎng)過濾等方法對細(xì)胞進(jìn)行純化，離心重懸后各取出一部分細(xì)胞用于流式檢測。

1.2.2小鼠ACEⅡ的鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測提取的AECⅡ中SPC陽性的比率以確定純度，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.2.3輻射誘導(dǎo)小鼠AECⅡ發(fā)生EMT的檢測 小鼠用1%的戊巴比妥鈉麻醉(麻醉劑量50 mg/kg)后固定于照射裝置上，10 cm厚鉛磚屏蔽除胸部以外的其他部位，采用60Coγ射線20 Gy單次照射全胸，劑量率215 cGy/min。照射14 d后，取對照、照射小鼠各3只，提取AECⅡ，標(biāo)記E-cadherin、ZO-1和N-cadherin抗體，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4輻射誘導(dǎo)A549細(xì)胞、Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞發(fā)生EMT的檢測 采用60Coγ射線8 Gy照射A549細(xì)胞、Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化2 min，BEP-2D細(xì)胞用0.25%胰酶在37 ℃孵箱消化5 min，Beas-2B細(xì)胞用0.05%胰酶消化30 s，分別加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，PBS清洗重懸后分別標(biāo)記E-cadherin、ZO-1和N-cadherin抗體，流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1小鼠AECⅡ的分離與純化為了探究電離輻射是否能誘導(dǎo)小鼠AECⅡ發(fā)生EMT，首先對小鼠AECⅡ進(jìn)行了分離，經(jīng)過胰酶消化、離心等步驟得到AECⅡ，將獲得的AECⅡ標(biāo)記SPC抗體進(jìn)行流式檢測，得到SPC陽性表達(dá)率為70.8%(圖1A)。隨后經(jīng)過800 r/min離心和40 μm篩網(wǎng)過濾等步驟對AECⅡ進(jìn)行純化，流式檢測SPC表達(dá)陽性的細(xì)胞所占比例逐步增加，分別達(dá)到 85.2%和87.1%(圖1B、1C)。提示通過該方法能夠得到純度較高的小鼠AECⅡ。

2.2小鼠AECⅡ的電鏡觀察鑒定為了對小鼠AECⅡ進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，將經(jīng)過純化的AECⅡ培養(yǎng)48 h，之后進(jìn)行電鏡觀察，電鏡下可觀察到小鼠AECⅡ外側(cè)有微絨毛，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞質(zhì)較多，并能觀察到特征性的板層小體結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 電鏡觀察小鼠AECⅡ形態(tài) ×3 200

A：小鼠AECⅡ整體形態(tài)；B：小鼠AECⅡ特征性板層小體結(jié)構(gòu)

2.3電離輻射對小鼠AECⅡ的影響經(jīng)過上述方法，能夠得到純度較高的小鼠AECⅡ。為了進(jìn)一步研究電離輻射是否能使小鼠AECⅡ發(fā)生EMT，從對照組小鼠與照射14 d的小鼠的肺組織中提取AECⅡ并進(jìn)行流式檢測。以上皮標(biāo)志E-cadherin和ZO-1的表達(dá)率為橫坐標(biāo)，N-cadherin的表達(dá)率為縱坐標(biāo)，以上皮標(biāo)志和間質(zhì)標(biāo)志共同表達(dá)于同一細(xì)胞，即第一象限(E-cadherin+N-cadherin+的象限和ZO-1+N-cadherin+的象限)表示正在發(fā)生EMT的細(xì)胞(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測E-cadherin+N-cadherin+AECⅡ比例及ZO-1+N-cadherin+AECⅡ比例，結(jié)果顯示照射后的小鼠AECⅡ中E-cadherin+N-cadherin+AECⅡ比例及ZO-1+N-cadherin+AECⅡ比例明顯升高(P<0.05)(表1)，表明正在發(fā)生EMT的細(xì)胞增多，提示輻射能夠誘導(dǎo)小鼠AECⅡ發(fā)生EMT。

圖3 電離輻射對小鼠AECⅡ形態(tài)及上皮、間質(zhì)標(biāo)志物的影響

A：流式檢測EMT相關(guān)蛋白；B：照射前后發(fā)生EMT細(xì)胞相對比例(照射20 Gy組正在發(fā)生EMT的細(xì)胞/0 Gy組正在發(fā)生EMT的細(xì)胞)柱形圖；與0 Gy組比較：*P<0.05

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測電離輻射對不同細(xì)胞發(fā)生EMT的影響

2.4電離輻射對人上皮細(xì)胞系的影響

2.4.1電離輻射對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的影響 根據(jù)上述實驗結(jié)果，證實電離輻射能夠誘導(dǎo)小鼠AECⅡ發(fā)生EMT，但其對人上皮細(xì)胞系的作用尚未證實，因此采用60Coγ射線8 Gy照射人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞以及人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞，以探究電離輻射是否能夠誘導(dǎo)人上皮細(xì)胞系發(fā)生EMT。

首先觀察了人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，A549細(xì)胞照射后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于光鏡下觀察，對照組細(xì)胞形態(tài)呈立方形或小鵝卵石形，具有上皮細(xì)胞典型的鋪路石樣特征；照射組與對照組相比細(xì)胞間隙增大，極性消失，形態(tài)有長梭形改變(圖4A)。流式細(xì)胞儀檢測E-cadherin+N-cadherin+細(xì)胞比例及ZO-1+N-cadherin+細(xì)胞比例。結(jié)果顯示照射后E-cadherin+N-cadherin+細(xì)胞比例及ZO-1+N-cadherin+細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)(圖4B、4C)。表明電離輻射能夠誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖4 電離輻射對A549細(xì)胞形態(tài)及上皮、間質(zhì)標(biāo)志物的影響

A：光鏡下檢測A549細(xì)胞形態(tài)×400；B：流式檢測EMT相關(guān)蛋白；C：照射前后發(fā)生EMT細(xì)胞相對比例柱形圖；與0 Gy組比較：*P<0.05

2.4.2電離輻射對人支氣管上皮細(xì)胞的影響 光鏡下觀察Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈立方形鋪路石樣特征；照射48 h后，細(xì)胞間隙均增大，形態(tài)逐漸向紡錘樣細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變(圖5A、5D)。流式細(xì)胞儀分別檢測到照射后的兩種細(xì)胞E-cadherin+N-cadherin+細(xì)胞比例及ZO-1+N-cadherin+細(xì)胞比例與對照組相比均有明顯升高(P<0.05)(圖5B、5C、5E、5F)。表明電離輻射能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞發(fā)生EMT。

3 討論

肺纖維化是以多種原因引起的上皮細(xì)胞受損、修復(fù)障礙，從而導(dǎo)致大量細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、異常間質(zhì)細(xì)胞活化和增生為特征的疾病[4]。大量間質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞)積聚及增殖是肺纖維化發(fā)生的重要原因[5]。肺泡上皮細(xì)胞是多種原因?qū)е碌姆螕p傷的主要受損靶細(xì)胞，當(dāng)損傷的肺組織進(jìn)行正常修復(fù)時，殘存的AECⅡ可通過自身增殖或者因具有部分干細(xì)胞特性而分化為AECI，或通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制向成纖維細(xì)胞特性分化，若其轉(zhuǎn)化過多的成纖維細(xì)胞，則組織病理表現(xiàn)為肺纖維化[6]。

EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞在某些生理或病理因子的刺激下，經(jīng)過多重生化改變，最終呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程[7]。EMT分為三型，Ⅰ型EMT與胚胎的形成以及器官的發(fā)育密切相關(guān)，Ⅱ型 EMT與傷口愈合、組織再生和器官纖維化有關(guān)，Ⅲ型 EMT與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究重點關(guān)注Ⅱ型 EMT即 EMT與器官纖維化的關(guān)系。

近年來的研究[8-9]表明小鼠肺纖維化模型中超過30%的成纖維細(xì)胞來自于EMT過程，EMT在肺纖維化中扮演著重要的角色。高燁 等[10]的實驗結(jié)果表明EMT在百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化中起著重要作用。還有研究[11]顯示EMT過程出現(xiàn)在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中。電離輻射誘導(dǎo)的肺損傷和肺纖維化是接受胸部放射治療、骨髓移植或參與核事故的患者常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥[12-14]，也是導(dǎo)致這些患者治療后期死亡的主要原因之一。由于RPF的機(jī)制尚不清楚，目前還缺乏有效的治療方法。因此，對RPF形成機(jī)制的研究尤為重要。然而，盡管EMT與多種因素引起的肺纖維化密切相關(guān)，電離輻射誘導(dǎo)EMT發(fā)生及其在RPF中的作用卻鮮有報道。同時大部分關(guān)于EMT與肺纖維化的研究主要采用A549 細(xì)胞和Beas-2B細(xì)胞建立細(xì)胞模型，基于AECⅡ在參與肺纖維化形成過程中的重要作用，本研究首次將小鼠原代AECⅡ分離、純化并用于電離輻射誘導(dǎo)EMT的研究。EMT發(fā)生時，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，失去細(xì)胞間E-cadherin和ZO-1的表達(dá)，獲得N-cadherin的表達(dá)[3,15]。很多情況下，細(xì)胞發(fā)生不完全的間質(zhì)化，同一細(xì)胞同時表現(xiàn)出上皮和間充質(zhì)特性[16]，因此主要對這部分細(xì)胞進(jìn)行了檢測。檢測的方法主要采用流式細(xì)胞術(shù)，這種方法能夠高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，能夠高效地對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。本研究結(jié)果表明電離輻射確實能夠在多種肺上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，使肺上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞特性分化，進(jìn)而增加引起RPF的可能性。同時，以ZO-1+N-cadherin+表示的發(fā)生EMT的AECⅡ細(xì)胞在電離輻射誘導(dǎo)后較對照組增加了7倍之多，這一比例高于其他幾種細(xì)胞系，表明小鼠原代AECⅡ是用于RPF研究的較為理想的細(xì)胞。本研究為探討AECⅡ在放射性肺纖維化中的作用提供了新的方法，并為進(jìn)一步研究EMT在放射性肺纖維化中的調(diào)控機(jī)制以及尋找RPF的有效的治療靶點提供了新的思路。

圖5 電離輻射對Beas-2B細(xì)胞和BEP-2D細(xì)胞形態(tài)及上皮、間質(zhì)標(biāo)志物的影響

A：光鏡下檢測Beas-2B細(xì)胞形態(tài)×400；B：流式檢測Beas-2B細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白； C：照射前后Beas-2B細(xì)胞發(fā)生EMT細(xì)胞相對比例柱形圖；與0 Gy組比較：*P<0.05；D：光鏡下檢測BEP-2D細(xì)胞形態(tài)×400；E：流式檢測BEP-2D細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白；F：照射前后BEP-2D細(xì)胞發(fā)生EMT細(xì)胞相對比例柱形圖；與0 Gy組比較：*P<0.05