夏洪麗 程俊 喻大鵬 陳文捷,4 魯義善
(1. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院,深圳 518116;2. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湛江 524003;3. 廣東省水生動物健康評估工程技術(shù)研究中心,深圳 518116;4.中國科學(xué)院水生生物研究所,武漢 430072)
近年來,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,養(yǎng)殖業(yè)面臨的諸多問題也日益突出,尤其是病原感染引起的水產(chǎn)病害,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。疾病的發(fā)生是由病原、宿主和環(huán)境三者相互作用的結(jié)果,其中宿主的免疫應(yīng)答對抵御病原微生物的感染具有重要作用,因此研究魚類免疫應(yīng)答機制一直是學(xué)術(shù)界的熱點,特別是在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮關(guān)鍵作用的先天性免疫。肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)作為一種重要的模式識別受體,在魚類抵御病原侵染過程中扮演著十分重要的角色。目前有關(guān)魚類PGRPs的研究已經(jīng)取得了一定的進展,本文綜述了魚類PGRPs的結(jié)構(gòu)、表達及其功能,旨在為魚類先天性免疫的研究提供理論參考。
肽聚糖識別蛋白(Eptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是一類可識別肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)的模式識別受體家族,最早發(fā)現(xiàn)于家蠶血淋巴中[1]。隨后,在昆蟲[2]、棘皮動物[3]和脊椎動物[4-5]中相繼被發(fā)現(xiàn)。目前已報道的魚類PGRP共23種(表1)。根據(jù)氨基酸序列的不同,PGRPs主要分為3類:短型PGRPs(Short-PGRPs,PGRP-S)、中型 PGRPs(Intermediate-PGRPs,PGRP-I)和長型PGRPs(Long-PGRPs,PGRP-L)[6]。果蠅 PGRPs主要分為兩類:一類是較短的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,包括PGRPSA、-SB1、-SB2、-SC1A、-SC1B、-SC2和-SD;另一類是較長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,包括PGRP-LAa、-LAb、-LAc、-LB、-LCa、-LCx、-LCy、-LD、-LE 和 -LF[5,7]。哺乳動物PGRPs有不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:PGRP-S、PGRP-Iα、PGRP-Iβ 和 PGRP-L,也稱為 PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3 和 PGLYRP-4[3,8]。 迄 今,在包括斑馬魚(Danio rerio)[9-11]、巖魚(Sebastes schlegeli)[12]、 美 國 紅 魚(Sciaenops ocellatus)[13]、草 魚(Ctenopharyngodon idella)[14-16]、 斑 點 叉 尾鮰(Ictalurus punctatus)[17]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[18]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[19]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[20-21]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[22]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[23]和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[24]等魚類中發(fā)現(xiàn)3類PGRPs,其中PGLYRP-2與哺乳類PGLYRP-2為同源物,而PGLYRP-5(也稱為PGRPSC)和PGLYRP-6則是魚類所特有的[17]。
表1 11種硬骨魚的肽聚糖識別蛋白
在結(jié)構(gòu)上,所有PGRPs的C端通常包含至少一個高度保守的PGRP結(jié)構(gòu)域,與噬菌體T7溶菌酶和細菌的II型酰胺酶有一定的相似性,而PGRPs在N端的序列長度差異較大,在不同生物間并不保守[3]。人類PGRPs都含有信號肽結(jié)構(gòu),而信號肽是蛋白質(zhì)經(jīng)典分泌途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu);然而,斑馬魚PGRP2,PGRP5并不含信號肽結(jié)構(gòu),但斑馬魚PGRPs也均是分泌蛋白[5,25-26],其機制尚不明確。盡管魚類PGRPs在大小、結(jié)構(gòu)域布局及亞細胞定位方面有一定差異,但其C端的PGRP結(jié)構(gòu)域是高度保守的。哺乳動物PGRP結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象是由位于中心的幾個 β 片層和外圍的 3 個 α 螺旋(α1-α3)組成[27]。研究表明,魚類PGRPs也有類似的結(jié)構(gòu),而個別剪切體因某個氨基酸位點的缺失,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)上稍有不同[9,16,24]。
PGRP結(jié)構(gòu)域都含有高度保守的半胱氨酸位點,其形成的二硫鍵是賦予PGRPs功能活性和維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定所必須的重要結(jié)構(gòu)[28]。研究表明,該結(jié)構(gòu)域中的某半胱氨酸位點突變將使其喪失酰胺酶活性[29-31]。晶體結(jié)構(gòu)顯示,PGRP結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的正面凹槽含有保守的Zn2+結(jié)合位點,由兩個組氨酸、一個酪氨酸和一個半胱氨酸組成,是結(jié)合肽聚糖的活性中心;其另一面為PGRP特異,且不保守的疏水區(qū)域,不同于催化酰胺鍵水解反應(yīng)的II型酰胺酶結(jié)構(gòu)[31-34]。研究表明,結(jié)合PGN的凹槽結(jié)構(gòu)被破壞后,將使其無法識別PGN,從而失去酰胺酶活性[29-30]。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn),魚類PGRPs基本也都含有4個Zn2+結(jié)合位點,如圖1所示。說明魚類PGRPs與哺乳動物可能有類似的功能,但其作用機制是否也依賴于半胱氨酸殘基還有待進一步研究。
魚類PGRPs在不同器官/組織中廣泛表達,但其表達組織和表達量都存在明顯差異。與斑馬魚PGRP2類似,美國紅魚、大黃魚和大菱鲆PGRP2在各組織中普遍存在,尤其在肝臟中表達量最高[9,13,18,22]。巖魚 PGRP-L1 在腸和脾臟中表達量較高;其次是鰓和皮膚等,而PGRP-L2僅在肝臟中表達[12]。實驗表明,在不同細菌的刺激下,魚類PGRPs在各免疫組織的表達量均明顯改變。因此推測魚類PGRPs參與了機體的免疫應(yīng)答過程,且發(fā)揮效應(yīng)的部位各不相同,如草魚PGRP6a、PGRP6d通過鰓和皮膚發(fā)揮作用,而PGRP6b的效應(yīng)部位是腸,脾臟和肝臟等[16]。魚類PGRPs的廣泛表達將有利于機體及時將體內(nèi)感染的病原體清除。同時,在非免疫組織中的表達說明PGRPs在生理過程過可能也扮演著重要角色。此外,實驗表明,魚類PGRPs在胚胎發(fā)育早期階段的先天性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18,26]。
圖1 魚類肽聚糖識別蛋白的多序列比對結(jié)果
利用生物信息學(xué)軟件 Clustalx 和 MEGA5.0構(gòu)建了N -J(Neighbor-joining)進化樹,對來自人類、小鼠、原雞、非洲爪蟾和斑馬魚等14個物種(表2)的PGRPs 的進化關(guān)系進行分析,結(jié)果表明,不同物種的PGRP-S和 PGRP-L分別獨立進化,即同種類型PGRPs聚為一支,而與本物種的其他類型PGRPs同源性相對較低,這與以往的報道高度一致[3,35](圖 2)。
表2 14個物種的肽聚糖識別蛋白
PGN是幾乎所有細菌細胞壁的主要成分,包括L-賴氨酸(Lys型)和二氨基庚二酸(Dap型)兩種類型,Lys 型 PGN主要存在于革蘭氏陽性菌中,而Dap 型 PGN 是革蘭氏陰性菌的主要組成成分[36]。當(dāng)細菌或其他含PGN的外源物體侵染機體時,能被宿主PGRPs識別并與之結(jié)合,從而激發(fā)機體的免疫效應(yīng)。人PGLYRP3結(jié)合PGN后,其PGRP結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象隨即發(fā)生改變,將目標(biāo)物固定在凹槽內(nèi),提高結(jié)合過程的親和力[34,36-38]。研究表明,魚類PGRPs能夠結(jié)合 Lys型和 Dap 型兩種 PGN[14-15,26]。除了PGN以外,人和鼠PGRPs還能夠結(jié)合脂膦壁酸(LTA),脂多糖(LPS)等聚合物,但對后兩者的親和力明顯較低,但豬PGLYRP1對LTA和LPS有很強的親和力[39-41]。根據(jù)文獻報道,PGN、脂膦壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)和Ploy I:C均能夠誘導(dǎo)草魚PGRP5和PGRP6的高表達[14-16]。說明草魚PGRP5、PGRP6與哺乳動物PGRPs類似,能夠識別不同的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMPs),至于其相互作用的親和力是否有差異,還有待進一步的研究。
PGRPs能夠水解細菌肽聚糖中N -乙酰胞壁酸與 L-丙氨酸之間的酰胺鍵,將有活性肽聚糖的分子片段化,從而使其失去活性,達到清除細菌的目的[31,42]。人 PGLYRPs中,僅 PGLYRP2具有酰胺酶活性[36]。研究表明,保守的Zn2+結(jié)合位點對于PGRPs發(fā)揮酰胺酶活性是必須的[33-34]。如圖2所示,魚類PGRPs的C端含有保守的半胱氨酸殘基,暗示其和人PGLYRP2一樣,都具有酰胺酶活性。文獻報道多種魚類的PGRPs都具有酰胺酶活性,且呈Zn2+依賴性[11-15,23-24],2012 年,孫黎等克隆美國紅魚PGLYRP2和PGLYRP2-AD(酰胺酶結(jié)構(gòu)域),分別進行原核表達,分離純化重組蛋白,并進行枯草芽孢桿菌肽聚糖的水解實驗,結(jié)果顯示,PGLYRP2和PGLYRP2-AD都具有酰胺酶活性,水解肽聚糖[13]。
當(dāng)PGRP與微生物細胞壁成分結(jié)合后形成復(fù)合物,能夠激活酚氧化酶,經(jīng)過一系列反應(yīng),將含酚的化合物氧化成醌,轉(zhuǎn)換成黑色素將微生物包裹來限制其感染[2]。哺乳動物PGRPs只有酰胺酶活性或者殺菌活性,與PGLYRP2不同,人PGLYRP-1,PGLYRP-3,PGLYRP-4在對應(yīng)Cys530位點上是絲氨酸而非半胱氨酸,無法結(jié)合Zn2+,因此PGLYRP-1,PGLYRP-3,PGLYRP-4 只有殺菌活性[30,43-44]。后兩者形成的異二聚體PGLYRP3:4也同樣有高效的殺菌作用[44]。研究表明,魚類PGRPs同一分子往往兼具酰胺酶和殺菌兩種特性[12,26]。除了酰胺酶活性以外,巖魚PGRP-L1和PGRP-L2還具有廣譜殺菌功能[12]。因此猜測PGRPs的殺菌機制與其自身的酰胺酶活性可能存在某種關(guān)聯(lián),但目前還沒有相關(guān)的實驗證實這一猜想。斑馬魚PGRPs不僅能有效殺滅革蘭氏陽性菌,對革蘭氏陰性菌也表現(xiàn)出不同程度的殺菌作用。然而,美國紅魚PGLYRP2只對革蘭氏陽性菌有很強的殺滅作用[13]。魚類PGRPs在抗菌免疫中表現(xiàn)各異,即使同一物種的不同PGRPs分子的作用也不盡相同,至于其作用機制還有待進一步研究。
圖2 PGRPs的系統(tǒng)進化樹
PGRPs在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,包括免疫調(diào)節(jié)過程[31,42,45]。除了識別病原體,PGRPs還通過調(diào)節(jié)機體免疫以便能夠及時有效地清除入侵的病原體。研究表明,并非所有的PGRPs都有很強的殺菌作用。例如,半滑舌鰨PGRP-SC2并非是直接殺死細菌的效應(yīng)物,而是通過提高細胞的吞噬能力來抑制機體內(nèi)細菌的定植與傳播[23]。與此類似,羅非魚PGRP-SC2并未表現(xiàn)出明顯的殺菌作用,卻能顯著降低靶器官內(nèi)無乳鏈球菌的載量,說明其在抵抗無乳鏈球菌感染過程中扮演著重要角色[24]。
起初認為PGRPs是一個簡單的效應(yīng)分子,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)昆蟲PGRPs能夠激活Toll或IMD信號傳導(dǎo)通路或誘導(dǎo)蛋白水解級聯(lián)反應(yīng),從而提高抗菌免疫反應(yīng)[45]。研究表明,魚類PGRPs不僅是典型的模式識別受體,還可介導(dǎo)細胞內(nèi)的Toll、MAPK、JAK/STAT和NF-KB多條信號通路,從而調(diào)節(jié)下游免疫相關(guān)基因的表達。由于昆蟲PGRPs的水解肽聚糖的酰胺酶活性,可以防止機體出現(xiàn)過度炎癥反應(yīng),因此推測哺乳動物PGRPs也有抗炎效應(yīng)[42,46-47]。然而,與預(yù)期結(jié)果相反,實驗表明哺乳動物PGLYRP2在PGN感染機體過程中發(fā)揮了促炎效應(yīng)[48]。為探究魚類 PGRPs的功能,Jang 等[20]通過構(gòu)建酰胺酶失活突變體,發(fā)現(xiàn)虹鱒PGRP-L1能夠抑制IL-1β和TNF-a等下游炎性因子的表達,說明虹鱒PGRP-L1發(fā)揮了抗炎功能,且該調(diào)節(jié)機制與其酰胺酶活性無關(guān)。此外,魚類PGRPs能促進穿孔素、抗菌肽的分泌,從而在機體的抗菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)[16]。
選擇性剪切是單個基因剪切合成多功能信使RNA的過程,是真核生物中普遍存在的一種現(xiàn)象,會影響免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[49]。草魚PGRP6的不同剪切體雖然都能抑制體內(nèi)細菌的增長,但其作用機制也各不相同。PGRP6a,PGRP6b和PGRP6c能誘導(dǎo)鐵調(diào)素和G-溶菌酶的表達,而草魚PGRP6和PGRP6d卻無此功能。另外,4個剪切體中只有PGRP6c能夠影響穿孔素的分泌,說明在抑菌活性的基礎(chǔ)上,草魚PGRP6的不同剪切體還有功能特異性[16]。
PGRPs在機體先天性免疫過程中發(fā)揮著重要作用,目前有關(guān)魚類PGRPs的研究已經(jīng)取得了一定的進展,然而對其作用機制的研究還不夠深入。PGRP-L的N端幾乎占據(jù)整個分子的2/3,該段蛋白的結(jié)構(gòu)差異較大的原因是什么,以及發(fā)揮的作用是怎樣的;PGRPs的殺菌作用與酰胺酶活性是否存在一定的聯(lián)系。以往的報道發(fā)現(xiàn),PGRPs能夠抵御真菌的感染,且軟體動物PGRPs對寄生蟲刺激也有一定的防御作用,那么魚類PGRPs是否也有類似的功能。
免疫信號通路是一個十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。PGRPs作為分泌蛋白,卻能顯著抑制NF-kB活性,因此,推測細胞內(nèi)可能存在某種表面受體來協(xié)助PGRP完成信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),至于受體是什么又是如何發(fā)揮作用的,就不得而知了。研究表明,虹鱒PGRP-L1和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding oligomerization domains,NODs)在抗菌免疫應(yīng)答中存在相互依賴,并能夠調(diào)節(jié)部分炎癥因子的表達,但對IL-10的表達卻沒有任何影響[50]。那么PGRPs與其他免疫信號是否也有一定的關(guān)聯(lián);又是如何影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),以上問題都需要進一步的研究探索。