崔燕兵 邢志霞 林帥軍 劉偉

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）08-1036-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.06

摘 要 目的：建立乙肝益氣解郁顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法，色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為水-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以芍藥苷為參照，測定10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰。結(jié)果：10批樣品的HPLC圖譜有34個(gè)共有峰，相似度均大于0.98；經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為乙肝益氣解郁顆粒的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 乙肝益氣解郁顆粒； 高效液相色譜法； 指紋圖譜；芍藥苷

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Yigan yiqi jieyu granules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of water-acetonitrile （gradient elution） at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using paeoniflorin as control， HPLC chromatograms of 10 batches of samples were determined. The similarity was evaluated by using TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A version） to determine common peak. RESULTS： There were 34 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples， with the similarities>0.98. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of were in good agreement with control fingerprint. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of Yigan yiqi jieyu granules.

KEYWORDS Yigan yiqi jieyu granules； HPLC； Fingerprint； Paeoniflorin

乙肝益氣解郁顆粒是收載于2010、2015版《中國藥典》（一部）的中藥成方制劑[1]。該制劑由柴胡、丹參、黃芪、黃連、枳殼、五味子、白芍等16味中藥材組合而成，具有益氣化濕、疏肝解郁之功效，用于火毒血熱所致的身熱煩躁、目赤口瘡、咽喉腫痛、大便秘結(jié)；咽炎、扁桃體炎、牙齦炎見上述證候者。已有標(biāo)準(zhǔn)對該藥只進(jìn)行了簡單的定性鑒別，含量測定部分僅以高效液相色譜法（HPLC）對芍藥苷含量進(jìn)行了檢測。目前指紋圖譜已經(jīng)成為國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的技術(shù)之一[2-3]，本研究通過HPLC法建立了10批乙肝益氣解郁顆粒的指紋譜圖，以期從整體上控制其質(zhì)量，保證其臨床用藥安全。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元梯度泵、DAD 檢測器（美國Agilent公司）；AB135-S型、XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-S24型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

乙肝益氣解郁顆粒[遼寧華潤本溪三藥有限公司，批號(hào)：20160505、20160510、20160515、20160602、20160608、20160616、20160620、20160625、20160629、20160709（編號(hào)為S1～S10），規(guī)格：10 g/袋]；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號(hào)：0753-201504，純度：≥98.0%）、芍藥苷對照品（批號(hào)：0753-201410，純度：≥98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L[4-6]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇定容，制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷質(zhì)量濃度均為50 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱定樣品5 g，研細(xì)，加90%甲醇溶液50 mL使溶解，超聲（功率：250 W，頻率：35 kHz）處理50 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)糜? mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20160505）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定，以芍藥苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，34個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20160505）適量，分別于室溫下放置在0、3、6、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以芍藥苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，34個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：20160505）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以芍藥苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，34個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版），以藥材樣品共有模式為對照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)[7-8]。結(jié)果顯示，10批樣品相似度均大于0.98，表明樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見表2。

2.4.3 HPLC指紋圖譜中共有色譜峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A 版）對10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。10批樣品有34個(gè)共有峰，通過與對照品對照，指認(rèn)出8號(hào)峰為芍藥苷。 8號(hào)峰分離良好，峰面積最大且為所有樣品共有，確定其為參照峰，計(jì)算其他峰相對于8號(hào)峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，詳見表3～表4。

3 討論

本課題組預(yù)試驗(yàn)時(shí)考察了甲醇、90%甲醇、80%甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇溶液和水作為提取溶劑時(shí)的提取效果。結(jié)果顯示，甲醇、乙醇作為提取溶劑所得圖譜雜峰較多，分離度低，所得的色譜圖特征不明顯，無法作為本試驗(yàn)的提取溶劑；90%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)仍存在供試品不穩(wěn)定的問題，但所得的色譜峰較好，綜合比較后選擇90%甲醇溶液作為提取溶劑。確定提取溶劑后，進(jìn)行了超聲提取法和回流提取法對比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取所得的峰不穩(wěn)定，數(shù)次進(jìn)樣所得的色譜圖相差較大，而超聲提取相對較穩(wěn)定，且所得峰數(shù)、峰形、峰高較好，所以選擇超聲提取法[9-11]。

本課題組先后考察了甲醇-水、乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)不同的梯度洗脫程序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，所得的峰分離效果都不佳，且基線不平穩(wěn)；而乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，基線相對平穩(wěn)，所得色譜峰分離效果較好，所以選擇乙腈-水作為流動(dòng)相，需要注意的是，為了防止樣品測定時(shí)基線漂移，建議樣品測定結(jié)束后都應(yīng)進(jìn)行30 min的色譜柱平衡操作，之后方可進(jìn)行下一個(gè)樣品的測定。

本課題組以8號(hào)峰（芍藥苷）為參照峰，計(jì)算得到的10批樣品34個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間的RSD為0.03%～1.47%，相對峰面積的RSD為0.12%～3.41%。從34個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間看，3號(hào)峰、17號(hào)峰、21號(hào)峰的相對保留時(shí)間的RSD略微偏大，3個(gè)峰對應(yīng)的相對峰面積的RSD為0.60%、0.29%、0.15%，從峰面積看變化極小，保留時(shí)間的偏移可能是由洗脫劑經(jīng)混合后的不穩(wěn)定引起的。從相對峰面積看，28號(hào)峰的相對面積的RSD偏大為3.41%，其對應(yīng)的保留時(shí)間RSD為0.53%，峰面積的差異可能與原料藥材質(zhì)量有關(guān)，提示在選藥投料生成前應(yīng)注意原來藥材成分的檢測。當(dāng)然該成分對整個(gè)處方臨床療效的影響如何需要結(jié)合以后的譜效學(xué)進(jìn)行研究[5]。

盡管本課題組基本完成了乙肝益氣解郁顆粒的HPLC色譜指紋圖譜的研究，但綜合來看，尚有諸多需要提高之處。由于處方大，質(zhì)量控制起來相對困難。中藥譜效關(guān)系是以指紋圖譜為基礎(chǔ)，將指紋圖譜中特征化學(xué)成分變化與中藥藥效結(jié)合起來，闡明與藥效相關(guān)的活性成分，從而建立能反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法[12]。就乙肝益氣解郁顆粒而言，應(yīng)進(jìn)一步開展譜效學(xué)研究，精選有效成分，剔除無效成分，從而達(dá)到給本藥“瘦身”的目的。

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（收稿日期：2017-07-04 修回日期：2017-08-16）

（編輯：張 靜）