邱紅梅 楊林 何丹

中圖分類(lèi)號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）12-1605-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.05

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定鼻炎靈片中綠原酸、黃芩苷和歐前胡素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters SunFire C18，流動(dòng)相為甲醇-0.20%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：綠原酸、黃芩苷和歐前胡素的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.618～16.18、1.624～16.24、1.762～17.62 μg/mL（r均為0.999 9）；定量限分別為2.67、2.03、1.87 μg/mL，檢測(cè)限分別為1.34、1.06、0.98 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%；加樣回收率分別為98.01%～101.80%（RSD=1.38%，n=9）、98.38%～101.40%（RSD=1.26%，n=9）、98.06%～101.40%（RSD=1.28%，n=9）；耐用性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于鼻炎靈片中綠原酸、黃芩苷和歐前胡素含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；鼻炎靈片；綠原酸；黃芩苷；歐前胡素；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid， baicalin and imperatorin in Biyanling tablets. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on a Waters SunFire C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.20% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： Linear ranges of chlorogenic acid， baicalin and imperatorin were 1.618-16.18 μg/mL， 1.624-16.24 μg/mL and 1.762-17.62 μg/mL （r were 0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 2.67，2.03，1.87 μg/mL， and the limits of detection were 1.34， 1.06， 0.98 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The recoveries were 98.01%-101.80%（RSD=1.38%，n=9）， 98.38%-101.40%（RSD=1.26%，n=9）and 98.06%-101.40%（RSD=1.28%，n=9）， respectively. RSDs of tolerance tests were all lower than 2.0%. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable. It can be used for simultaneous determination of hlorogenic acid， baicalin and imperatorin in Biyanling tablets.

KEYWORDS HPLC； Biyanling tablet； Chlorogenic acid； Baicalin； Imperatorin； Content determindtion

鼻炎靈片是由炒蒼耳子、辛夷、白芷、黃芩、川貝母、細(xì)辛、淡豆豉、薄荷腦等8味中藥材經(jīng)提取制成的口服制劑，具有通竅消腫、祛風(fēng)退熱的功效，臨床上多用于慢性鼻竇炎、鼻炎及鼻塞頭痛、濁涕臭氣、嗅覺(jué)失靈等癥的治療[1]。該制劑收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜法對(duì)白芷、黃芩和川貝母進(jìn)行鑒別，以高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定黃芩苷的含量，并規(guī)定每片含黃芩以黃芩苷計(jì)不得少于2.4 mg[1]。蒼耳子、黃芩、白芷為該方的主要藥材，因此該制劑的質(zhì)量控制應(yīng)采用多指標(biāo)成分控制。蒼耳子主要含有綠原酸、原兒茶酸等酚酸類(lèi)成分[2-3]，具有降血糖、抗過(guò)敏、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[4]；黃芩主要含有黃芩苷等成分[5]，具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)靜、解熱、降血壓、降血脂及降膽固醇等作用[6]；白芷中主要含有歐前胡素和異歐前胡素等香豆素類(lèi)成分[7]，具有抗炎、抗瘧、抗菌、抗腫瘤等作用[8]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)量控制方法多以HPLC法分別測(cè)定該制劑中黃芩苷[9]、綠原酸[10]、木蘭脂素[11]和歐前胡素[12]的其中1種或2種成分的含量，但未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定該制劑中綠原酸、黃芩苷和歐前胡素含量的報(bào)道。本研究采用HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定鼻炎靈片中上述3種成分含量的方法，旨在為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20型HPLC儀，包括SPD-20A紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；AG135型電子分析天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；KQ-1100DE型超聲波清洗儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鼻炎靈片（江西南昌制藥有限公司，批號(hào)：170306、170402、170508，規(guī)格：0.3 g/片）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201415，純度：≥99.0%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110896-200001，純度：≥99.0%）、歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110826-201013，純度：≥99.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.20%磷酸溶液，梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10.11 mg、黃芩苷對(duì)照品10.15 mg、歐前胡素對(duì)照品11.01 mg，各置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得各自單一對(duì)照品貯備液。分別量取上述3種單一對(duì)照品貯備液各1.0 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得綠原酸、黃芩苷和歐前胡素質(zhì)量濃度分別為16.18、16.24、17.62 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20 片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz） 處理 40 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按鼻炎靈片處方和工藝制備缺炒蒼耳子、白芷、黃芩的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，陰性對(duì)照在與綠原酸、黃芩苷和歐前胡素保留時(shí)間相同處無(wú)色譜峰干擾，表明專(zhuān)屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以綠原酸、黃芩苷和歐前胡素質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸、黃芩苷和歐前胡素回歸方程分別為y=17 386x+50 694（r=0.999 9）、y=45 610x+56 650（r=0.999 9）、y=22 240x+31 953（r=0.999 9）。結(jié)果表明，綠原酸、黃芩苷和歐前胡素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.618～16.18、1.624～16.24、1.762～17.62 μg/mL。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和歐前胡素的定量限分別為2.67、2.03、1.87 μg/mL，檢測(cè)限分別為1.34、1.06、0.98 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，1 d內(nèi)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和歐前胡素峰面積的RSD分別為1.32%、1.18%、0.98%（n=6），表明日內(nèi)精密度良好。取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)3 d進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和歐前胡素峰面積的RSD分別為1.48%、1.35%、1.28%（n=3），表明日間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170306）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果， 綠原酸、黃芩苷和歐前胡素峰面積的RSD分別為1.25%、1.08%、1.18%（n=6），表明供試品溶液室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取樣品細(xì)粉（批號(hào)：170306）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷和歐前胡素含量平均值分別為2.330、4.412、3.526 mg/片，RSD分別為1.50%、1.27%、1.19%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品細(xì)粉（批號(hào)：170306）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 色譜柱考察 取樣品細(xì)粉（批號(hào)：170306）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[色譜柱分別為Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Cosmocore C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，色譜柱一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.10.2 流動(dòng)相考察 取樣品細(xì)粉（批號(hào)：170306）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流動(dòng)相磷酸溶液體積分?jǐn)?shù)分別為0.20%、0.15%、0.10%）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，流動(dòng)相一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.10.3 流速考察 取樣品細(xì)粉（批號(hào)：170306）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，流速一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.10.4 柱溫考察 取樣品細(xì)粉（批號(hào)：170306）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（柱溫別為25、30、35 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，柱溫一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

由于綠原酸、黃芩苷和歐前胡素極性差別較大，故筆者采用梯度洗脫，并在流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中分別采用不同體積分?jǐn)?shù)的磷酸溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.20%磷酸溶液條件下，上述3種成分峰形對(duì)稱(chēng)，可滿足測(cè)定要求。在檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)化過(guò)程中筆者選用280 nm和328 nm兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在280 nm波長(zhǎng)處上述3種成分的色譜峰峰形較好，且整個(gè)基線更為平穩(wěn)。筆者還曾以甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，可能是制劑中某些輔料的干擾所致，結(jié)果不理想；而后發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相作為提取溶劑提取最為完全，加樣回收率符合規(guī)定。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于鼻炎靈片中綠原酸、黃芩苷和歐前胡素含量的同時(shí)測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1686

[ 2 ] JIANG H， YANG L， LIU C， et al. Four new glycosides from the fruit of Xanthium sibiricum Patr[J]. Molecules， 2013， 18（18）：12464-12473.

[ 3 ] 姜海，張妍妍，張穎.蒼耳子化學(xué)成分研究[J].中醫(yī)藥信息，2016，33（3）：8-10.

[ 4 ] 劉玉紅，郝震峰.蒼耳子的化學(xué)成分和藥理作用研究概述[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017，33 （4） ：22-23.

[ 5 ] 徐丹洋，陳佩東，張麗，等.黃芩的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（1）：78-80.

[ 6 ] 文敏，李雪，付守延.黃芩苷藥理作用研究新進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（2）：158.

[ 7 ] 張建方，黃健，葉優(yōu)苗.HPLC法測(cè)定利鼻片中歐前胡素的含量[J].中國(guó)藥房，2013，24（12）：1135-1136.

[ 8 ] 夏令先，王玉斌，黃文龍，等.香豆素類(lèi)化合物的抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2013，22（20）：2392-2402.

[ 9 ] 郝晶晶，甄會(huì)賢，趙正保.鼻炎靈片中黃芩苷含量測(cè)定方法的研究[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，14（1）：38-40 .

[10] 孫亮，鄭巍，陸萍，等.鼻炎靈膠囊中綠原酸和黃芩苷的含量測(cè)定及指紋圖譜研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2016，16（3）：196-199.

[11] 夏清山.HPLC測(cè)定鼻炎片中木蘭脂素的含量[J].鄂州大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，17（5）：18-19.

[12] 越春香，粱蕊，互麗娜.HPLC法測(cè)定鼻炎靈片中歐前胡素的含量[J].中草藥，2004，35（6）：642-643.

（收稿日期：2017-10-23 修回日期：2018-01-09）

（編輯：張 靜）