柯昌虎 黃慧敏 趙陽 李志浩

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1864-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.32

摘 要 目的：為全面控制中藥三七的質(zhì)量提供參考。方法：以“三七”“指紋圖譜”“Panax notoginseng”“Fingerpint”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2003年1月-2017年12月在中國知網(wǎng)、萬方、維普、PubMed等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻，對三七指紋圖譜的相關(guān)研究進行綜述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻209篇，其中有效文獻80篇。目前三七指紋圖譜分析方法主要有色譜法（包括高效液相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳色譜法、氣相色譜法等）、光譜法（包括紅外光譜法、紫外光譜法、熒光光譜法、核磁共振等）、非線性化學法、生物學方法等。三七化學指紋圖譜的研究報道較多，特別是色譜指紋圖譜廣泛應用于三七及其制劑的質(zhì)量評價，而基于其指紋圖譜與藥效作用結(jié)果的譜-效關(guān)系研究有待進一步深入。

關(guān)鍵詞 三七；指紋圖譜；檢測技術(shù)；質(zhì)量控制

中藥三七[Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen]為五加科人參家族植物，盛產(chǎn)于云南、廣西、貴州等地區(qū)，藥用歷史已達數(shù)百年，是我國治療血證的傳統(tǒng)中藥，被認定為“外傷科之圣藥、止血之神藥、理血之妙品”[1]。三七的根莖（剪口）、支根（筋條）、葉、花等部位均可用于治療疾病，且常以主根入藥[2]，是三七化瘀口服液、三七配方顆粒、三七通舒膠囊、血塞通注射液等中藥制劑的有效成分之一，以其為配方的許多制劑大多納入了《國家基本藥物目錄》?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，三七藥材在止血活血、保護心血管、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤等方面藥效顯著，主要依賴其天然皂苷類活性成分。目前已從三七不同部位中分離出80余種達瑪烷型皂苷，人參皂苷Rb1（G-Rb1）、人參皂苷Rd（G-Rd）、人參皂苷Re（G-Re）、人參皂苷Rg1（G-Rg1）和三七皂苷R1（N-R1）這5種皂苷成分常用于三七藥材含量分析及內(nèi)在質(zhì)量控制的考察指標[3-5]。其中，G-Rb1、G-Rg1、N-R1在三七總皂苷中含量分別高達30%、20%、2.5%[6]，在2015年版《中國藥典》（一部）中，上述3種成分被列為三七的藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制指標[7]。

由于受到產(chǎn)地、生長環(huán)境、年限、采收時間等因素的影響，三七藥材質(zhì)量不一，從而直接造成臨床用藥療效的不穩(wěn)定，加之市場上三七藥材質(zhì)量差異大，商品質(zhì)量更是真?zhèn)坞y辨，給臨床用藥安全帶來危害[8-9]。目前在相關(guān)研究中，由于缺乏皂苷參照或色譜分離能力差，半數(shù)以上的總皂苷還不能被定量檢測，而可供應的參照物遠遠不符合分析要求[5，10]。因此，借助現(xiàn)代技術(shù)，全面、系統(tǒng)地控制三七藥材內(nèi)在質(zhì)量，對確保產(chǎn)品的安全與穩(wěn)定尤為重要。指紋圖譜分析是基于現(xiàn)代光譜、色譜、分子生物學技術(shù)等方法而建立起來的質(zhì)量控制模式，并逐步應用于中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，成為確定其身份、真實性和一致性的有力工具。與經(jīng)驗鑒別“辨狀論質(zhì)”、初期的理化鑒別等傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法比較，指紋圖譜可以更全面地反映出中藥復雜體系的內(nèi)部狀況，獲得準確而完整的指紋，實現(xiàn)中藥的穩(wěn)定與可控，現(xiàn)已成為諸多中藥及其制劑質(zhì)量控制的重要手段[11-12]。另外，將指紋圖譜特征與藥物作用效應進行有機結(jié)合而建立起譜-效關(guān)系，可以更好地闡明藥效物質(zhì)基礎。筆者以“三七”“指紋圖譜”“Panax notoginseng”“Fingerpint”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2003年1月-2017年12月在中國知網(wǎng)、萬方、維普、PubMed等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻209篇，其中有效文獻80篇?，F(xiàn)對三七指紋圖譜的相關(guān)研究進行綜述，以期為全面控制中藥三七的質(zhì)量提供參考。

1 色譜指紋圖譜

色譜能反映中藥的“化學成分”，以中藥色譜指紋圖譜來鑒別中藥的真?zhèn)魏侠砜尚?，已被廣泛應用于中藥質(zhì)量控制中，包括高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳色譜（CE）、薄層色譜（TLC）、氣相色譜（GC）等方法。國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）明確要求[10]，所有的中草藥注射劑及相關(guān)原料在標準化中使用色譜指紋圖譜。色譜指紋圖譜通過建立共有模式，指認特征共有峰及數(shù)目，借助相似性估計、主成分分析（PCA）和聚類分析等化學計量學方法來實現(xiàn)不同來源中藥的質(zhì)量評價[13-14]。

1.1 液相色譜

1.1.1 HPLC （1）三七藥材的HPLC指紋圖譜分析。HPLC具有分離效能高、分析速度快、應用范圍廣等優(yōu)點，是中藥指紋圖譜研究最廣泛的檢測方法之一。建立不同產(chǎn)地及不同批次三七藥材的HPLC指紋圖譜共有模式，可為其全面質(zhì)量控制提供參考。白長財?shù)萚15]收集20批不同產(chǎn)地的三七藥材，以甲醇提取，乙腈-水梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度在0.931～0.995之間，19個共有峰中7個主要的指紋峰（3、4、5、14、15、16、17）得到確認，分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1、G-Rg2、G-Rh1、G-Rd，所建立的方法適用于三七等含有弱或無紫外吸收成分中藥材的分析。張迅杰等[16]收集10批三七藥材，以70%乙醇進行超聲提取，乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度均在0.755～0.963之間，39個共有峰中指認了6個主要色譜峰（7、8、9、19、22、31），分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rf、G-Rb1、G-Rd，該分析方法為三七藥材的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。劉小紅等[17]對三七藥材用70%乙醇回流提取，以分離總皂苷為主線軸，采用正向剔除分離法制備得到4種不同伴生物組成的三七總皂苷（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），各6批，以乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度均>0.99，4種醇提三七總皂苷各有10個共有峰，N-R1、G-Rg1、G-Rb1均可在指紋圖譜中得以追溯。閆炳雄等[18]采集10批三七藥材，將其發(fā)酵產(chǎn)物進行指紋圖譜研究，以甲醇超聲提取，乙腈-水梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度均>0.98，14個共有峰中8個色譜峰（2、3、4、5、6、8、12、14）得到確認，分別為G-Rg1、G-Re、G-Rb1、G-Rg2、G-Rh1、G-Rd、G-Rg3、G-CK，并可作為鑒別三七發(fā)酵產(chǎn)物物質(zhì)基礎的重要指標，從而為全面控制三七發(fā)酵產(chǎn)物總皂苷的質(zhì)量提供理論依據(jù)。劉曉麗等[19]以三七藥材制備10批三七總皂苷，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜共確定了22個共有峰，并應用色譜指紋圖譜指數(shù)F等參數(shù)、雙定性雙定量相似度法和系統(tǒng)指紋定量法對三七總皂苷質(zhì)量進行評價，為三七總皂苷的質(zhì)量控制提供方法。

（2）三七不同藥用部位的HPLC指紋圖譜分析。對三七不同藥用部位HPLC分析并建立其指紋圖譜，不僅能發(fā)映出藥用部位和生產(chǎn)工藝不同造成的含量差異，還可以準確分辨三七不同藥用部位的質(zhì)量。崔翰明等[20]采用甲醇對三七多個部位（主根、筋條、剪口、葉、花）進行超聲提取，以乙腈-水進行線性梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同規(guī)格三七根（20～100頭）和剪口、筋條的HPLC指紋圖譜接近，相似度>0.971，三七主根與花和葉相似度分別為0.596和0.564，17個特征峰中8個色譜峰（4、5、6、7、8、9、10、11）得到確認，分別為N-R1、G-Rg1或G-Re、G-Rf、G-Rb1、G-Rc、G-Rb2、G-Rb3、G-Rd；又在相同色譜條件下對不同來源的三七總皂苷提取物進行指紋圖譜分析時發(fā)現(xiàn)，三七主根、剪口和筋條3個不同部位之間以及不同生產(chǎn)工藝條件下，其主要特征峰峰面積及比例差異明顯，在同一生產(chǎn)工藝下，三者總皂苷提取物差異不大，14個特征峰中8個色譜峰（1、2、3、4、5、6、7、8）得到確認，并與前期研究結(jié)果保持一致[21]。陳彤等[22]采用70%甲醇分別對10批三七總皂苷和10批三七剪口藥材進行超聲提取，以乙腈-水進行梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度均≥0.995，10個共有峰中指認了5個色譜峰（1、2、3、5、9），分別為N-R1、G-Rg1或G-Re、G-Rf、G-Rb1、G-Rd，5種皂苷含量之和達84.7%，含量測定結(jié)果平均值的RSD不超過3.23%，表明三七剪口提取三七總皂苷的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。

（3）三七飲片的HPLC指紋圖譜分析。建立三七飲片HPLC指紋圖譜，對生、熟三七進行對比研究，不僅可為其鑒別提供依據(jù)，也可為解決生、熟三七品質(zhì)評價提供科學的方法。李琳等[23]采集活性三七飲片和傳統(tǒng)干燥三七藥材各10批，以甲醇提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度均在0.90～1.00之間，8個共有峰中指認的5個色譜峰（1、2、3、7、8）分別為N-R1、G-Rg1、G-Rb1、G-Re、G-Rd，且活性三七中上述5個指標成分的含量均高于傳統(tǒng)干燥三七藥材，表明活性三七飲片的指紋圖譜適用于活性三七飲片的質(zhì)量控制。陳煒璇等[24]分別采集三七藥材飲片11批、破壁粉體和破壁飲片各12批，以70%甲醇超聲提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度>0.9，8個共有峰中3個共有峰（1、2、4）得到確認，分別為N-R1、G-Rg1、G-Rb1，建立的HPLC指紋圖譜方法具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，適用于三七破壁飲片的質(zhì)量控制。陳榮潔等[25]采用70%甲醇對10批熟三七進行超聲提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在18個共有峰中指認出14個色譜峰（1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14、15、17、18），分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1、G-Rc、20S-G-Rh1、20R-G-Rh1、G-Rd、G-Rk3、G-Rh4、20S-G-Rg3、20R-G-Rg3、G-Rk1、G-Rg5，其中G-Rg1、G-Rb1和G-Rh4為熟三七的特征峰，且G-Rh4是區(qū)別熟三七和生三七的重要成分。連艷等[26]對10批熟三七飲片進行指紋圖譜研究，以甲醇提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC圖譜相似度>0.9，在16個共有峰中指認了6個色譜峰（1、2、5、12、13、14），分別為N-R1、G-Rg1、G-Rb1、G-Rc、20S-G-Rg3、20R-G-Rg3，可為熟三七飲片的鑒別及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

（4）三七相關(guān)制劑的HPLC指紋圖譜分析。應用HPLC指紋圖譜對三七相關(guān)制劑進行評價分析，可為解決中藥配方在不具備飲片外形后的品種真?zhèn)舞b別和質(zhì)量優(yōu)劣的評價上提供科學的方法，也為保證臨床用藥的安全、有效提供依據(jù)。周絢[27]分別取三七藥材、三七總皂苷和三七緩釋片各10批，以70%甲醇提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者共有峰數(shù)目分別為 17、15、14個，三七藥材的相似度>0.82，三七總皂苷提取物、三七緩釋片的相似度均>0.95，三者指紋圖譜整體特征相關(guān)性良好，三七皂苷類成分分布及比例穩(wěn)定，中間體、成品與原料藥材的相關(guān)性良好、質(zhì)量穩(wěn)定。江國華等[28]收集10個批次三七化瘀口服液，以甲醇超聲提取，乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖譜相似度均在0.9～1.0之間，共有峰12個。畢曉黎等[29]采用甲醇對10批三七配方顆粒進行超聲提取，以乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖譜相似度>0.9，18個共有峰中3個色譜峰（3、4、7）得到確認，分別為N-R1、G-Rg1、G-Rb1，可用于三七配方顆粒的定性鑒別。馬再鴻等[30]對10批三七通舒膠囊進行指紋圖譜研究，以乙腈進行提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖譜相似度>0.96，樣品標定4個共有指紋峰（1、2、3、4），分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1，且上述4種主要有效成分的相對比例較穩(wěn)定，所建立的方法可用于三七通舒膠囊的質(zhì)量控制。

1.1.2 超高效液相色譜 超高效液相色譜（UPLC）在HPLC的基礎上發(fā)展而來，憑借其優(yōu)良的分離性能和高通量的檢測水平，使成分復雜的中藥體系的定性和定量檢測、代謝組學方面的研究更為準確和高效，可用于中藥的成分鑒別、含量測定、指紋圖譜、代謝標記物等方面的研究[31]。三七中的皂苷類成分紫外吸收較弱，尤其在中藥復方中皂苷含量很低，從而對檢測方法提出了更高的要求[32]。胥愛麗等[33]對10批三七配方顆粒進行UPLC指紋圖譜研究，以甲醇超聲提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖譜相似度均>0.9，11個共有指紋峰中指認出3個色譜峰（1、2、3），分別為N-R1、G-Rg1和G-Rb1，所建立的UPLC指紋圖譜可用于三七配方顆粒的快速定性鑒別，并為三七配方顆粒的快速質(zhì)量評價提供方法。董宏然等[34]采用80%甲醇超聲提取10批丹七軟膠囊（丹參、三七），以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈梯度洗脫，208 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖譜相似度>0.980，32個共有峰中18個成分來自三七，所建立的指紋圖譜穩(wěn)定可靠，靈敏度高，可以作為丹七軟膠囊的質(zhì)量控制標準。李學林等[35]對20批注射用血栓通（凍干）進行UPLC指紋圖譜研究，以70%甲醇提取，乙腈-水梯度洗脫，203 nm為檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖譜相似度均>0.98，13個共有峰中指認出5個色譜峰（5、7、8、11、13），分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1、G-Rd。與HPLC比較，UPLC更加快速高效，可以作為注射用血栓通（凍干）的質(zhì)量控制的重要參考方法之一。

1.1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC- MS）技術(shù)將色譜高分離能力和質(zhì)譜的靈敏性有機結(jié)合起來，可以更好地了解中藥的藥理基礎，并成為連接中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學的橋梁[36]。中藥大多是從動植物中得到，化學成分豐富多樣、藥理活性顯著有效且毒性較低，但由于缺乏科學的分析評價方法，中藥的價值一直未被充分認識。在中草藥處方及中藥制劑中，大量的藥物成分混合在一起，給中藥的分離和檢測分析工作帶來巨大的挑戰(zhàn)。MS是一種無標記技術(shù)，特異性強，可以通過離子的質(zhì)荷比可靠地檢測出分子，而串聯(lián)質(zhì)譜掃描模式則可以進一步提高檢測的靈敏度和特異性，特別適用于復雜樣品的分析，已廣泛應用于皂苷、黃酮類、生物堿類等許多中藥活性成分的分析[37-38]。冷靜等[39]采用HPLC-MS法對三七三醇皂苷（15批）及三七通舒腸溶微丸膠囊（10批）進行指紋圖譜研究，以20%乙腈水溶液提取，乙腈-水梯度洗脫，采用電噴霧離子源（ESI），負離子化模式下進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，譜圖相似度>0.94，指認共有峰14個，離子碎片圖譜中確定第2、3、4、5、9號峰分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rf、G-Rb1。曹怡等[40]采用100倍量水飽和正丁醇超聲提取三七樣品，選用ESI離子源，正負離子模式下的全掃描，掃描范圍m/z 300～2 000（MS1），m/z 50～2 000（MS2和MS3），建立了三七質(zhì)量評價半微量方法，液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（LC- MS-IT-TOF）技術(shù)指認出指紋圖譜中的16個皂苷類成分（1～16），分別為N-R1、G-Rg1、G-Re、Ace-G-Rg1、N-R4、N-Ra、G-Rf、G-Rb1、N-R2、Mal-G-Rb1、G-Rg2、G-Rh2、Iso-G-Rb1、G-Rd、Mal-G-Rd、N-K，包括8個人參三醇型皂苷（1、2、3、4、7、9、11、12）和8個人參二醇型皂苷（5、6、8、10、13、14、15、16）。結(jié)果表明，利用指紋圖譜相似度評價及對特征峰峰面積提取可進行三七的質(zhì)量分析，避免了測定過程的煩瑣及費用昂貴問題，為三七樣品的質(zhì)量分析提供了簡便、快速和準確的評價方法，且可應用于三七不同年限等樣品的質(zhì)量評價。趙靜等[41]以乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫，ESI負離子模式，采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q- TOF-MS）法對三七中化合物進行快速分析，結(jié)果可將17種皂苷類成分劃分為5種類型，即Ⅰ型皂苷[原人參二醇型（PDS）]、Ⅱ型皂苷[原人參三醇型（PTS）]、Ⅲ型皂苷（擬人參皂苷F11）、Ⅳ型皂苷[齊墩果烷型（G-R0）]和Ⅴ型皂苷（G-Rk1）；同時，對多種難以區(qū)分的同分異構(gòu)體（如G-Rc、G-Rb2、G-Rg3、擬人參皂苷F11等）也能進行有效區(qū)分。該方法可為快速鑒定和分析含有三七皂苷和人參皂苷類成分的化合物提供參考，并為全面表征三七指紋圖譜提供依據(jù)。

1.1.4 譜-效關(guān)系 指紋圖譜使中草藥的質(zhì)量控制和標準得到提升，譜圖中的主要成分被認為是中草藥質(zhì)量評價的標志物，但無法反映出藥物的治療作用。借助譜-效關(guān)系可以將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與藥效結(jié)果之間的聯(lián)系反映出來，并找出與藥效活性相關(guān)的藥效成分群，從而建立中藥產(chǎn)品與其療效基本一致的反映產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的評價體系。在中藥液相指紋圖譜分析的基礎上，通過譜-效關(guān)系建立中草藥綜合評價體系，可以闡明特征圖譜與藥效的相互關(guān)系，反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量，同時確定藥效物質(zhì)基礎[42-43]。通過對三七的譜-效關(guān)系研究，確定用于三七全面質(zhì)量控制的主要活性成分，以期為建立三七全面質(zhì)量評價體系提供參考和依據(jù)。劉旭等[44]采用甲醇超聲提取，乙腈-水梯度洗脫，檢測波長203 nm，建立了三七藥材的HPLC指紋圖譜，以大鼠心肌缺血模型為對象，研究中藥三七對大鼠心肌缺血保護作用譜-效關(guān)系及藥效物質(zhì)基礎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-R1（峰1）、G-Rg1（峰2）、G-Rb1（峰3）、G-Re（峰5）均與治療心肌缺血作用呈正相關(guān)，是中藥三七治療心肌缺血的主要有效成分，所建立的評價三七藥材譜-效關(guān)系的新方法為該類中藥的進一步研究提供了新的思路；劉旭課題組又以心肌缺血模型為對象進行譜-效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，N-R1（峰1）、G-Rg1（峰2）、G-Rb1（峰3）均與藥效呈顯著正相關(guān)，其中G-Rb1可顯著降低血清中乳酸等物質(zhì)水平的升高，G-Rg1可顯著降低血清游離脂肪酸（FFA）水平升高，是中藥三七治療心肌缺血的主要有效成分。通過譜-效關(guān)系研究獲得了藥效活性物質(zhì)，建立了三七藥材譜-效關(guān)系評價的方法，客觀反映了藥物內(nèi)在質(zhì)量，為該類中藥的創(chuàng)新研究提供了借鑒[45]。趙玉瓏[46]將三七復雜化學成分UPLC指紋圖譜與其抗凝藥效相結(jié)合，研究了三七二醇苷（PDS）、三七三醇苷（PTS）和三七總皂苷（PNS）抗凝作用的“量-效”關(guān)系，并與三七花和葉中皂苷成分的抗凝作用進行了比較。將樣品色譜峰峰面積與其凝血酶原時間（PT）值聯(lián)系，建立了線性方程模型，發(fā)現(xiàn)N-R1、G-Rb1、G-Rd和一個未知成分為其質(zhì)量控制的主要活性物質(zhì)；量-效關(guān)系試驗結(jié)果顯示，三七根和三七葉中PDS的抗凝活性顯著高于其他樣品，且三七葉中的PDS可能是潛在的新型抗凝藥物。

1.2 CE

CE已成為藥物質(zhì)量控制的有效工具，廣泛應用于藥用植物成分的分離鑒定，如茶多酚、糖類、脂類、生物堿、萜類化合物等。在天然復雜成分的分離和定量上，與其他分析方法比較，CE具有峰容量高、樣品和試劑用量少、分離效率高、靈敏度高、成本-效益高等優(yōu)點，為中藥及其復方制劑的分析、鑒定及指紋圖譜建立提供了一種高效、準確的方法[47-48]。劉金丹[49]采用CE法對12批市售三七藥材進行分析，考察了不同提取條件、背景電解質(zhì)和分離電壓3個因素對電泳圖譜的影響，以背景電解質(zhì)50 mmol/L硼砂-200 mmol/L硼酸（1 ∶ 1，V/V），運行電壓12 kV，檢測波長203 nm，建立云南產(chǎn)三七的指紋圖譜。結(jié)果，共確定18個共有峰，建立的CE指紋圖譜成為三七質(zhì)量控制的一種新工具。李霞等[50]以10批次復方丹參滴丸為對象，50 mmol/L硼砂-硼酸緩沖鹽（內(nèi)含30 mmol/L十二烷基硫酸鈉）為電泳緩沖鹽，分離電壓25 kV，檢測波長203 nm，建立了復方丹參滴丸的CE指紋圖譜。結(jié)果，在14個共有峰中，指認出4個色譜峰（2、3、4、6），分別為原兒茶醛、N-R1、G-Rg1、丹參素，建立的CE指紋圖譜測定方法快速、高效，為復方丹參滴丸的全面質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

1.3 TLC

TLC是一種成熟的可視化分析方法，操作簡便、成本低、通用性強、特異性強，可以直觀而形象地反映出中藥的特征，在中草藥評價中有著廣泛的應用[51]。TLC指紋圖譜可以在可見光或紫外光下，對衍生化前后的分離帶的數(shù)目、序列、位置和顏色進行比較。隨著儀器的進步與發(fā)展，高效薄層色譜（HPTLC）成為中草藥指紋圖譜分析強大的一種工具，適用于低或中等極性化合物的分析，且苯胺-二苯胺比色法的檢測靈敏度遠遠高于HPLC常用的示差折光檢測器（RI）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的靈敏度[52]。同時，HPTLC具有高通量、可重復、穩(wěn)定好等特點，與CE一樣，具有方法簡單、快速的優(yōu)勢[53]。顏玉貞等[54]采用預制硅膠高效薄層板（20 cm×10 cm），二氯甲烷-無水乙醇-水（70 ∶ 45 ∶ 6.5，V/V/V）為展開劑，硫酸乙醇溶液（10%）為顯色劑，于366 nm紫外燈下檢視三七樣品的熒光色譜。結(jié)果，建立了24個不同商品規(guī)格三七藥材皂苷類成分的HPTLC指紋圖譜，其中G-Rb1、G-Rd、G-Re、G-Rg1、N-R1等10個特征斑點的峰及其峰比值相對穩(wěn)定，提供的皂苷類成分分布信息可以快速考察商品三七的質(zhì)量。馬妮等[55]采用硅膠60預制板，氯仿-甲醇-水（65 ∶ 35 ∶ 10，V/V/V，取下層）為一次展開劑，氯仿-正丁醇-甲醇-水（4 ∶ 8 ∶ 3 ∶ 4，V/V/V/V，取下層）為二次展開劑，使三七中主要成分N-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1和G-Rd得到良好分離；以硫酸乙醇溶液（10%）為顯色劑，于366 nm波長處檢視，發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格和不同產(chǎn)地的三七根部和根莖的TLC指紋圖譜特征斑點一一對應，而根部與花、莖葉比較則明顯不同。結(jié)果表明，TLC能有效直觀地對三七藥材中皂苷成分進行快速鑒定，建立的TLC指紋圖譜可為完善三七質(zhì)量標準控制體系提供依據(jù)。王明科等[56]采用硅膠G薄層板，正丁醇-醋酸乙酯-水（4 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V，取上層）為展開劑，硫酸乙醇溶液（10%）為顯色劑，G-Rg1、G-Rb1、N-R1作為對照品，于365 nm波長處檢視，建立了三七丹參顆粒的TLC定性指紋圖譜，該方法準確、快速，可有效控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

1.4 GC

與LC比較，GC具有一些顯著的優(yōu)點，如流動相的黏度低，擴散系數(shù)大，使得流動阻力降低且傳質(zhì)速率加快，適用于低分子量化合物的分析[47]。中藥中含有許多活性揮發(fā)性物質(zhì)和低沸點成分，GC可在中藥的分析中發(fā)揮出重要作用。目前，GC及GC-MS聯(lián)用技術(shù)廣泛應用于中藥的揮發(fā)性成分分析，靈敏度高、穩(wěn)定性好、分析效率高，特別是GC與MS聯(lián)用，對復雜成分的定性分析提供了可靠的信息[51]。李麗明等[57]利用頂空固相微萃取-GC-MS法研究三七揮發(fā)性成分的化學成分組成，分離得到離子峰93個，鑒定得到83個化合物，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的95.83%，該方法簡便、環(huán)保、快速、靈敏，適用于三七揮發(fā)性成分的研究。梁賀升等[58]利用GC-MS儀對中藥三七蒸汽溶液進行分析研究，建立了三七藥材揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS圖譜。結(jié)果，總共辨析出46個色譜峰，通過檢索美國國家標準與技術(shù)局（NIST）的質(zhì)譜圖庫，測得了19種可能化合物，其中2-甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯酚、十四烷酸、十八碳二烯酸、二十五烷的可信度達95%以上，且從結(jié)構(gòu)上看，三七藥材中揮發(fā)性物質(zhì)大部分為苷類化合物。通過GC指紋圖譜分析三七所含組分，為其質(zhì)量鑒別提供借鑒作用。

2 光譜指紋圖譜

不同藥材所含物質(zhì)基礎不同，根據(jù)其相對應的光譜性質(zhì)的差異可以判斷藥材的品質(zhì)與質(zhì)量，包括紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）、熒光光譜（FS）、核磁共振（NMR）等方法。將中藥材及其制劑進行適當處理，經(jīng)光譜測定即可得到能夠標識該中藥材及其制劑共有模式的指紋圖譜。光譜指紋圖譜與色譜指紋圖譜一樣，應用于中藥及其制劑的研究中，成為中藥質(zhì)量控制的重要手段。

2.1 IR

IR可以提供分層的指紋圖譜（整體、部分和單一成分），其像“GPS”一樣，從系統(tǒng)到分子水平循環(huán)，可以“導航”中草藥綜合化學特征[59]。中草藥是一個復雜的體系，整個系統(tǒng)尚缺乏表征指標來呈現(xiàn)完整的分子信息。李建蕊[60]運用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術(shù)，對三七的剪口（根莖）、主根、筋條、絨根等不同部位以及表皮、韌皮部、形成層、木部等不同組織的一維IR和二階導數(shù)光譜進行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）絨根在1 741 cm-1和 1 384 cm-1處的特征吸收峰與剪口、主根、筋條峰形差異較大；剪口在1 077 cm-1峰的強度顯著高于主根、支根、絨根在1 080 cm-1附近特征峰的強度；主根與筋條整體峰形相似，兩者所含化學成分的種類基本相同。（2）在不同組織中，韌皮部、形成層和木部的主體成分均為淀粉。（3）三七剪口與其表皮的一維紅外光譜和二階導數(shù)光譜均在1 317 cm-1和781 cm-1處有草酸鈣的特征峰，且表皮中草酸鈣的含量更高。IR既能對三七不同部位、組織以及不同加工方法的樣品進行鑒別，又能揭示三七的主體成分、有機大分子和無機小分子成分等化學信息，IR指紋圖譜為三七藥材的質(zhì)量評價及其控制提供了一種準確、快速、無損的檢測方法，也為中藥材的微量研究提供了方法參考。李運[61]采用FTIR對云南道地藥材三七進行研究，建立了三七紅外指紋圖譜，結(jié)合偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、支持向量機（SVM）等化學計量學方法挖掘不同產(chǎn)地與地下部位三七圖譜化學信息，并進行鑒別。結(jié)果顯示，5個不同區(qū)域的三七IR相似度很高，3 400、2 930、1 731、1 643、1 152、1 079、 1 023、927 cm-1附近有8個明顯共有峰；區(qū)域鑒別正確率為94.29%，道地產(chǎn)地與非道地產(chǎn)地鑒別正確率為97.14%；對三七主根、剪口和須根粉末進行鑒別，鑒別正確率為100%。表明FTIR結(jié)合化學計量學方法能夠?qū)θ哌M行快速準確鑒別，建立的方法可為三七科學、合理、規(guī)范使用及質(zhì)量評價提供研究基礎。

2.2 UV

UV指紋可以表征樣品的化學性質(zhì)，借助PCA、PLS等評價工具，建立藥理學與光譜數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，可用于評價中藥制劑的藥效強度，有助于篩選不同草藥或不同技術(shù)制備的中草藥制劑[62]。基于指紋圖譜分析的中藥材或中藥材質(zhì)量分析與控制越來越受到人們重視，將多組分分析方法和指紋圖譜相結(jié)合被認為是在中草藥中篩選候選藥物的有效工具。三七中主要藥效成分為皂苷類，有較強的UV末端吸收。丁永麗[63]采用UV指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析、聚類分析、PCA和 PLS-MD 分析等多種指紋圖譜評價方法系統(tǒng)地研究了三七UV指紋圖譜，并探討了不同顯色劑對三七UV指紋圖譜的峰數(shù)目和吸收范圍產(chǎn)生的影響。丁永麗等[64]采用氯仿、乙醇、水分別提取三七樣品，同時在各溶劑提取液中加入一定量5%硫酸香草醛溶液，建立了三七UV指紋圖譜和三七-硫酸香草醛UV指紋圖譜。采用SIMCA軟件及共有峰率和變異峰率雙指標序列法進行分析時發(fā)現(xiàn)，加入硫酸香草醛的三七指紋圖譜的共有峰率數(shù)據(jù)較為集中（50%～70%），其變異峰率的范圍也較?。?0%～50%）。三七-硫酸香草醛UV指紋圖譜的相似性大于三七UV指紋圖譜，雙指標序列分析的結(jié)果與圖譜結(jié)果一致，表明兩種方法所得UV圖譜的差異性與三七產(chǎn)地和生長年限均相關(guān)。王元忠等[65]采集云南10個不同地區(qū)共50個三七樣品的紫外光譜時發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地三七樣品的紫外光譜峰形相似，主要共有峰為194、200、204、210、218 nm，吸光度分布在0～4.00之間，表明三七的主要成分組成與產(chǎn)地相關(guān)性低，含量與產(chǎn)地存在相關(guān)性。PLS-DA得分圖顯示10個產(chǎn)地樣品被分為4類，且圖譜有差異的樣品區(qū)分較為明顯。表明該方法能快速準確地對不同產(chǎn)地三七樣品進行定性分析，闡明樣品UV指紋圖譜與產(chǎn)地的關(guān)系，為中藥的資源鑒別提供理論參考。鐘貴等[66]采集越南產(chǎn)野三七的根部、葉部及云南產(chǎn)野三七的根部，提取其有效成分，利用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計方法對其進行鑒別分析，PCA及PLS-DA得分圖均顯示所有樣品聚為3類。越南產(chǎn)野三七根部、葉部及云南產(chǎn)野三七根部的UV-Vis指紋圖譜征共有吸收峰分別分布在206～310、206～800、206～400 nm，表明不同產(chǎn)地、部位和個體的野三七樣品存在明顯的差異。UV-Vis指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計方法能有效地鑒別不同產(chǎn)地和部位的野三七樣品，從而為中藥材的質(zhì)量控制、安全使用提供參考。

2.3 FS

FS是一種操作簡便、分析可靠、高效的分析方法，可以快速、準確地鑒定植物材料、油包水、非法毒品和酒中的多酚等[67]。中草藥中存在的某些化學成分（特別是有效成分）在紫外燈或可見光下可以產(chǎn)生一定的熒光，據(jù)此性質(zhì)可以實現(xiàn)FS檢測，F(xiàn)S現(xiàn)象可以反映出中藥材的內(nèi)在質(zhì)量。三七中含有共軛基團的成分在紫外光照射下會發(fā)射出FS。劉智等[68]采用FS對三七皮和芯的溶出物成分進行研究，發(fā)射波長為680 nm，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)現(xiàn)三七皮醇提液的FS圖中比三七芯的FS圖多1個熒光峰，據(jù)此表明三七皮與芯在成分上的差異。張舉成等[69]以血塞通凍干粉作為對照，采用固體三維熒光技術(shù)建立三七及其支根的固體三維FS指紋圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三七粉末熒光峰出現(xiàn)在230/340、290/340、370/480、430/540 nm，最強熒光峰為290/340 nm；三七支根的熒光峰出現(xiàn)在280/450、290/350、350 /440 nm，最強熒光峰為350/440 nm；血塞通凍干粉熒光峰出現(xiàn)在230/330、280/660、300/340、370/590、440/550、490/610 nm，最強熒光峰為300/340 nm。三者的熒光峰均出現(xiàn)在290～300/340～350 nm，且在血塞通凍干粉和三七粉末中該峰最強。另外，在血塞通凍干粉和三七粉末中有230/330～340 nm的熒光峰，三七支根沒有。因此，選取以上2個熒光峰作為特征熒光峰進行檢測，可以有效地鑒別三七粉末與三七支根，實現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量的快速評價。

2.4 NMR

NMR已成為鑒別中藥中有機化合物結(jié)構(gòu)的有力手段，其指紋圖譜具有高度的特征性和重現(xiàn)性，且與植物品種間存在十分準確的對應關(guān)系，譜圖所提供的中藥特征性化學成分的結(jié)構(gòu)和組成信息對于中藥生產(chǎn)中的質(zhì)量控制具有重要的實用價值。袁衛(wèi)梅等[70]采用購自北京、昆明、貴陽、鄭州、新鄉(xiāng)等地的商品三七藥材，規(guī)格包括20、30、40、60頭，建立了三七特征總提物B的1H-NMR指紋圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種規(guī)格的三七的1H-NMR指紋圖譜具有很好的一致性，表明其在特征性化學成分的組成方面是一致的。三七的藥用化學成分受到產(chǎn)地的影響，不同產(chǎn)地的三七樣品各區(qū)積分面積所占比重有一定差異。趙羽等[71]對三七主根樣品進行超聲提取，并用noesypr1d脈沖序列預飽和水峰壓制試驗，獲取了8種不同產(chǎn)地三七的1H-NMR指紋圖譜，峰形十分相似，表明化學成分近似；某些特征信號強度比例明顯不同，說明不同產(chǎn)地三七主根中的三萜皂苷的含量和組成比例不同。

3 非線性化學指紋圖譜

非線性化學指紋圖譜技術(shù)是一種基于化學振蕩和化學湍流等非線性化學反應的全新技術(shù)，其通過對樣品整體檢測化學或活性成分來反映樣品的整體信息。該技術(shù)無需分離和提純等預處理技術(shù)，是一種簡單、快速、經(jīng)濟的中藥鑒別和質(zhì)量控制技術(shù)。以非線性化學反應來表征中藥復雜體系成分群集特征的指紋圖譜，可以達到中藥材的混偽品及來源鑒別的目的[72-73]。羅志平等[74]采用非線性化學方法對超微三七粉進行研究，以0、4.2、9.2 kGy 3種劑量的60Co-γ射線對其進行輻照處理，建立了輻照前后三七粉非線性化學指紋圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻照劑量與振蕩壽命及停振時間之間存在良好的線性負相關(guān)關(guān)系；三七粉輻照前后的非線性化學指紋圖譜存在一定的差異，且重復性較好；而隨著輻照劑量的增大，輻照過的三七粉與未輻照處理的三七粉指紋圖譜中的系統(tǒng)相似度越來越小。表明非線性化學指紋圖譜技術(shù)可用于鑒別不同劑量輻照處理的超微三七粉。王東艷等[75]采用H+-Mn2+-CH3COCH3-BrO3為振蕩體系，加入中藥粉末在封閉體系中發(fā)生的非線性化學反應，通過記錄體系中電位隨時間的變化，獲得中草藥的電化學指紋圖譜。實驗測定了三七及其偽品（白術(shù)、莪術(shù)）的電化學指紋圖譜，中藥材（三七等）作為有機底物，與溶劑發(fā)生氧化還原反應，固定其他反應條件不變，加入不同反應底物，所得到的電化學指紋圖譜特色鮮明，三七及其偽品的電化學指紋圖譜具有明顯的差別，據(jù)此來鑒別三七。

4 生物指紋圖譜

在探討中藥藥理的過程中，人們發(fā)現(xiàn)生物指紋技術(shù)具有良好的選擇性和高通量性能，其結(jié)合了化學指紋和生物評價，特別適合于復雜成分、整體調(diào)節(jié)、多靶點中藥的分析，獲取信息量大、分析能力強且無污染，使其備受關(guān)注[76]。迄今為止，人們對中藥的藥理學依然知之甚少，對一些具有潛在毒性的植物、動物和礦物中藥心存疑慮，某些傳統(tǒng)的指紋識別技術(shù)已不能完全滿足該領(lǐng)域的新要求[77]。趙熙等[78]采用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)，對文山和廣西兩地的三七進行DNA指紋圖譜的鑒別研究，從45個引物中篩選出23個擴增穩(wěn)定且譜帶清晰的引物，獲得211個遺傳標記。結(jié)果顯示，不同樣品間有遺傳差異，各自具有不同的遺傳特征。張英等[79]采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)對三七及其7種偽品的18S rRNA和matK基因部分核苷酸序列以及不同產(chǎn)地三七的DNA分子特征進行測定時發(fā)現(xiàn)，三七及其偽品的核糖體18S rRNA基因序列存在很大的差異，而不同產(chǎn)地的三七的核糖體18S rRNA和葉綠體matK基因序列特征完全一致，結(jié)合三七的化學指紋特征，可以為三七的正品藥材基原鑒定提供分子和化學依據(jù)。張靖等[80]應用第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）序列DNA條形碼對三七飲片進行分子鑒定，利用化學指紋圖譜結(jié)合DNA分子鑒定技術(shù)進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三七精準煮散飲片與市售原飲片基本屬性相一致，但煮散飲片的浸出、有效成分溶出及質(zhì)量均一性均有明顯提高，提示煮散飲片可提高臨床用藥的精準性。

5 結(jié)語

三七是我國的名貴中藥，其止血、消腫、鎮(zhèn)痛等作用顯著，極具藥用價值，一直以來被廣泛應用于臨床。三七藥材質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響著藥物療效以及制劑的穩(wěn)定性與可控性，如何保證優(yōu)質(zhì)藥材來源，完善藥材質(zhì)量標準，利用現(xiàn)代分析技術(shù)把好藥材質(zhì)量關(guān)，是當下及未來中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的必然要求。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，能夠全面反映出中藥的內(nèi)部狀況，有效彌補單一指標成分質(zhì)量控制的弊端，成為中藥質(zhì)量評價的有力手段。三七化學指紋圖譜技術(shù)主要借助光譜、色譜等現(xiàn)代先進技術(shù)，建立三七藥材及其制劑的共有模式，可以較為全面地反映其所含復雜化學成分的整體情況及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，同時可以區(qū)分不同年限三七的質(zhì)量差異，能夠快速鑒定和分析含三七皂苷和人參皂苷化合物。非線性化學指紋圖譜是從非線性化學的角度對三七等中藥進行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制的一種新方法，與色譜、光譜指紋圖譜比較，該技術(shù)無需煩雜的預處理過程，適用于各種相態(tài)和劑型樣本的分析鑒別。三七生物指紋圖譜則利用基因組學和蛋白質(zhì)學技術(shù)，在分子水平上反映其遺傳多樣性，并體現(xiàn)其特殊性，即藥材的“道地性”，已成為三七等中藥材真?zhèn)舞b別的重要手段。

隨著三七的指紋圖譜研究的不斷深入，指紋圖譜與藥物效應之間構(gòu)建的譜-效關(guān)系日益引起關(guān)注。目前，三七譜-效關(guān)系研究尚處于初步階段，“譜”主要集中在液相色譜指紋圖譜，完整的“譜”還不能表征完整的“效”，無法完全實現(xiàn)“譜”“效”一致。因此，綜合運用各種現(xiàn)代分析技術(shù)對三七進行深入全面的分析研究，闡明三七的譜-效關(guān)系，明確藥效物質(zhì)基礎，全面控制三七藥材、飲片及其制劑的質(zhì)量，進一步完善其鑒別體系和質(zhì)量評價系統(tǒng)，不僅是三七的合理開發(fā)和應用的要求，更是臨床精準用藥的需要。

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（收稿日期：2018-02-23 修回日期：2018-05-14）

（編輯：余慶華）