張玉霞，張璐，王鵬銘，趙飛，趙躍武，葛英輝*

1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院影像科，河南鄭州 450003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科，河南衛(wèi)輝 453100；3.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院骨科，河南鄭州 450003；4.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院病理科，河南鄭州 450003；

由于反復(fù)關(guān)節(jié)出血導(dǎo)致的血友病性骨關(guān)節(jié)?。╤emophilic arthropathy，HA）是血友病患者常見的并發(fā)癥，具有很高的致畸率和致殘率，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。血友病目前的治療措施主要是凝血因子替代治療，治療費用高昂，而且也不能阻止慢性骨關(guān)節(jié)病的發(fā)展。如何進一步了解HA的發(fā)病機制，認識關(guān)節(jié)軟骨和滑膜病變等的早期可逆階段的變化，并早期進行干預(yù)治療是有效預(yù)防HA的關(guān)鍵。本課題組擬通過建立新西蘭大白兔關(guān)節(jié)內(nèi)出血模型，模擬HA患者早期關(guān)節(jié)內(nèi)出血的狀態(tài)，采用3.0T MR T2弛豫時間圖（T2-mapping）功能成像揭示形態(tài)學(xué)變化前、軟骨早期損傷的影像及病理表現(xiàn)，以期為臨床早期預(yù)防、干預(yù)和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本實驗經(jīng)河南省人民醫(yī)院動物實驗中心醫(yī)學(xué)倫理委員會允許，服從動物保護的倫理道德要求，批準文號：（2017）倫審第（49）號。

1.1 預(yù)實驗 通過預(yù)實驗時對軟骨厚度的測量，選取8月齡雄性新西蘭大白兔作為模型兔，合格證號為SCXK（豫）2013-0001，以股骨正中矢狀面的髕股關(guān)節(jié)面作為主要觀察對象（軟骨厚約1.4 mm）。

1.2 HA模型兔的建立及實驗步驟 選取8月齡新西蘭雄性大白兔15只，體重3.0～4.0 kg，購于河南省實驗動物中心。造模過程中2只因不耐受麻醉藥死亡，1只兔死于關(guān)節(jié)感染，12只兔順利完成實驗，建模成功。以兔右腿為模型側(cè)，左腿為空白對照。用 3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉（30 mg/kg），從耳緣采自體靜脈血2.5 ml，注入關(guān)節(jié)腔。關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)腔內(nèi)見暗紅色積血，提示造模成功（圖1）。因血友病患者關(guān)節(jié)出血后不完全制動，故兔在飼養(yǎng)過程中盡量不讓靜臥。在第1周和第2周末各重復(fù)注血1次，劑量同前。采用隨機數(shù)字表法將12只兔隨機分為兩組，每組6只，分別于第4周、第8周行MRI掃描，動態(tài)監(jiān)測雙膝關(guān)節(jié)軟骨變化，并于 MRI檢查后立即處死動物取材行病理檢查，行HE常規(guī)染色觀察軟骨改變。

圖1 以兔右腿為模型側(cè)，左腿為空白對照。從耳緣采自體靜脈血2.5 ml，注入關(guān)節(jié)腔，關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)腔內(nèi)見暗紅色積血，顯示造模成功

1.3 MRI檢查 采用GE Discovery 7503.0T MR掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)專用線圈。3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉（30 mg/kg）。模擬人膝關(guān)節(jié)MRI掃描，足先進，定位線位于兔髕骨下方切線。篩選出適合顯示兔膝關(guān)節(jié)早期軟骨改變的序列，分別為：①附加脂肪抑制的三維快速擾相梯度回波（3D-FS-SPGR）序列：TR 21.51 ms，TE 7.56 ms，層厚1.2 mm，無間距掃描，矩陣192×160，視野8 cm×8 cm，激勵次數(shù)2次；②T2-mapping：TR 1000.00 ms，TE 6.81、13.62、20.42、27.23、34.04、40.85、47.66、54.46 ms，層厚2.0 mm，層間距0.4 mm，矩陣192×128，視野8 cm×8 cm，激勵次數(shù)4次。

1.4 MRI圖像后處理及分析 將圖像輸入GE ADW 4.5圖像后處理工作站，得到股骨正中矢狀面的髕股關(guān)節(jié)面軟骨厚度、T2-mapping偽彩圖和T2值。感興趣區(qū)（ROI）測量：找到股骨正中矢狀面的髕股關(guān)節(jié)面連接前后緣的股骨骺線，然后以這條線的中點為中心，分別向與該線成1/4π、1/2π、3/4π的角度作直線，與軟骨的3個交點即為ROI選取點。每個ROI包含從骨皮質(zhì)到關(guān)節(jié)表面的軟骨區(qū)域，面積均為1 mm2（圖2）。

圖2 在T2-mapping上找到股骨正中矢狀面的髕股關(guān)節(jié)面連接前后緣的股骨骺線，然后以這條線的中點為中心，分別向與該線成1/4π、1/2π、3/4π的角度作直線，與軟骨的3個交點即為ROI選取點

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，Kolmogorov-Smirnov檢驗計量資料是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。采用配對樣本t檢驗分別比較第4周的模型側(cè)和對照側(cè)間、第8周的模型側(cè)和對照側(cè)間及第 4周與第 8周模型側(cè)間的 T2值，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI表現(xiàn) ①第4周和第8周模型側(cè)與對照側(cè)相比，3D-FS-SPGR序列所示軟骨未見明顯異常，滑膜無明顯增厚。②第4周，模型側(cè)T2-mapping偽彩圖未見明顯異常；第8周，模型側(cè)T2-mapping偽彩圖見股骨遠端軟骨正常的藍綠色階因軟骨損傷而出現(xiàn)紅黃色色階（圖3）。③第4周和第8周，模型側(cè)軟骨T2值均高于對照側(cè)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；模型側(cè)第8周T2值較第4周升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 關(guān)節(jié)內(nèi)出血模型側(cè)與對照側(cè)兔建模后不同時間行T2-mapping檢查的T2值比較（ ±s）

表1 關(guān)節(jié)內(nèi)出血模型側(cè)與對照側(cè)兔建模后不同時間行T2-mapping檢查的T2值比較（ ±s）

t值-2.509-4.332 P值0.0290.001

圖3 第8周，對照側(cè)脂肪抑制三維快速擾相梯度回波（3D-FS-SPGR）序列（A）和T2-mapping（B）像和模型側(cè)3D-FS-SPGR序列（C）和T2-mapping（D）像比較。A和C圖相比，軟骨形態(tài)差異不明顯，C中軟骨區(qū)域黑色信號，為關(guān)節(jié)腔內(nèi)的積血存留；B圖示正常股骨遠端軟骨呈藍綠色階，D圖因軟骨損傷而出現(xiàn)紅黃色階。對照側(cè)和模型側(cè)因關(guān)節(jié)腔積血伸展受限，軟骨顯影位置稍有偏差

2.2 病理表現(xiàn) 對照側(cè)關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨呈瓷白色，有光澤，均勻一致。顯微鏡下軟骨細胞分布均勻，細胞核、軟骨陷窩清晰可見（圖4A）。模型側(cè)第4周和第8周，關(guān)節(jié)軟骨表面均光滑，軟骨呈淡紅色，滑膜未見增厚。第8周關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見少量濃稠暗紅色積血，股骨外側(cè)髁軟骨表面局部不光滑，無潰瘍形成。顯微鏡下軟骨細胞排列紊亂，數(shù)目減少，軟骨陷窩增多，軟骨細胞核顯影模糊，細胞的分裂象增多（圖4B）。

圖4 關(guān)節(jié)內(nèi)出血模型側(cè)與對照側(cè)兔病理表現(xiàn)。顯微鏡下對照側(cè)軟骨細胞分布均勻，軟骨陷窩清晰（HE，×200，A）；模型側(cè)軟骨細胞排列稍紊亂，軟骨細胞稍減少，細胞核顯影模糊（HE，×200，B）

3 討論

HA的發(fā)病機制目前尚不清楚，反復(fù)的關(guān)節(jié)內(nèi)出血是滑膜和軟骨改變的始動因素。血液及其代謝產(chǎn)物可以直接損傷軟骨細胞[1]，多種血液成分可以觸發(fā)關(guān)節(jié)病進程[2]。Tan等[3]的研究結(jié)果表明，一次性的關(guān)節(jié)內(nèi)出血模型，在第3周會產(chǎn)生明顯的病理變化，但如果沒有反復(fù)的出血過程，在第1次出血后的第6周病變關(guān)節(jié)開始恢復(fù)正常，說明1次出血造成的軟骨和滑膜損傷有自愈機制，造成的損傷是可逆的。因此，HA的模型需要建立在關(guān)節(jié)腔多次出血的基礎(chǔ)上，這樣也更貼近血友病患者反復(fù)關(guān)節(jié)出血的真實臨床情況。本研究應(yīng)用多次膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)自體靜脈血注入來模擬HA患者靶關(guān)節(jié)反復(fù)出血的狀態(tài)。在這個模型中，出血量和出血時間均可以得到很好的控制，從而提供相對準確、可量化的指標和數(shù)據(jù)。兔膝關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)與人相似，軟骨的退變情況也與人接近，所以本實驗中選用兔作為模型實驗對象。

3D-FS-SPGR序列在高場強成像中，因其高信噪比、高分辨率的薄層壓脂技術(shù)及其對軟骨層狀結(jié)構(gòu)的顯示有助于診斷軟骨病變。T2-mapping是通過計算T2WI圖像中每個體素在不同回波時間下的 T2弛豫時間，利用圖像后處理軟件生成T2偽彩圖，即軟骨T2值的空間分布圖[4]。T2-mapping成像反映了軟骨內(nèi)水分子之間及水分子和周圍大分子之間的相互作用，可以根據(jù)水含量T2值的變化反映軟骨基質(zhì)內(nèi)各種成分的變化，進而反映軟骨的生理生化等信息[5]。軟骨內(nèi)水分子與周圍組織大分子（如膠原蛋白）之間的相互作用可以限制水分子的運動能力，病變軟骨膠原蛋白減少，水分子運動能力增加，導(dǎo)致含水量增加，從而引起T2值升高[6]。近年有學(xué)者針對HA的影像表現(xiàn)進行研究[7]，但是HA患者的T2-mapping成像表現(xiàn)僅有個案報道[8-9]。

軟骨損傷后，軟骨基質(zhì)及膠原纖維網(wǎng)排列改變，膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)破壞導(dǎo)致蛋白聚糖流失，引起病變區(qū)含水量及水分子活動能力增加，病變軟骨區(qū)域T2值升高，是早期軟骨損傷的重要征象。本實驗中，第4周和第8周，模型側(cè)關(guān)節(jié)軟骨T2值明顯高于對照側(cè)，此時形態(tài)學(xué)未見明顯變化，驗證了T2弛豫時間延長是關(guān)節(jié)軟骨損傷最早出現(xiàn)的征象，發(fā)生在軟骨變性的最初階段，與Liebl等[10]的研究結(jié)果一致。在軟骨病變早期，軟骨內(nèi)含水量與軟骨內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞嚴重程度呈正相關(guān)，水含量越多，T2值越高，預(yù)示軟骨內(nèi)組織結(jié)構(gòu)破壞越嚴重。Wei等[11]通過對膝關(guān)節(jié)軟骨標本的組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，T2值隨退變程度的增加而增高，且與水含量呈正相關(guān)，與糖胺聚糖含量呈負相關(guān)。模型側(cè)的T2值從第4周到第8周逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是HA發(fā)展過程中，首先發(fā)生軟骨腫脹以及含水量增加，同時伴有膠原纖維各向異性的變化，然后軟骨表面構(gòu)架崩解，使得膠原含量下降，同時伴隨水分丟失，即伴隨著HA的發(fā)展，軟骨內(nèi)的成分以及結(jié)構(gòu)異質(zhì)性亦不斷增加，所以T2值在整體上呈上升趨勢，但第8周的T2值與第4周比較，升高并不明顯。T2-mapping成像通過后處理產(chǎn)生不同的色階，反映了軟骨內(nèi)水分子的不同弛豫時間，因此在第8周破壞區(qū)軟骨色階上亦有相應(yīng)變化，而第4周色階變化不明顯可能與人的肉眼分辨率有關(guān)。

在軟骨出現(xiàn)輕微病理學(xué)改變時，滑膜增厚不明顯，與Hooiveld等[12]的“關(guān)節(jié)內(nèi)出血可直接對軟骨造成損害”這一觀點一致，但該論點在國內(nèi)外存在爭議，仍需要大樣本量研究支持。本研究的局限性在于，因前期實驗時間和標本量有限，未能對標本第8周以后的變化進行動態(tài)跟蹤，在今后的研究中會繼續(xù)進行更深入的探討。

總之，T2-mapping偽彩圖及其T2值早于3D-FSSPGR發(fā)生變化，T2-mapping作為一種功能MRI可以反映HA模型兔膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)變化之前的軟骨生化代謝變化。