李景華，張貴沛，趙朋超，馮文坡，李星星，鮑建峰

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023；

納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展為惡性腫瘤診療提供了一種新型有效的治療策略[1]?？蒲袑W(xué)者不斷推陳出新，開發(fā)了種類繁多的用于腫瘤診療的納米藥物遞送系統(tǒng)[2]，對(duì)腫瘤病灶進(jìn)行靶向遞送和精準(zhǔn)治療[3]。同時(shí)通過開發(fā)具有診斷治療一體化的多功能納米診療平臺(tái)，對(duì)病灶部位可視化分子影像探測(cè)，并進(jìn)行治療過程的時(shí)空調(diào)控，實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)可視化治療[4]。其中，基于多模態(tài)成像能力的光熱轉(zhuǎn)換納米材料的腫瘤光熱消融（photothermal therapy，PTT）治療，是一種通過光熱轉(zhuǎn)換劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能進(jìn)而使腫瘤組織達(dá)到一定溫度并死亡的新型癌癥治療方法，與傳統(tǒng)的放療或化療相比，其毒副作用較小，具有更高的生物相容性和治療安全性，引起諸多學(xué)者的關(guān)注和深入研究[5]。本研究擬采用美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證、在近紅外光區(qū)有強(qiáng)吸收并將光能轉(zhuǎn)換為熱能、具有良好生物相容性的普魯士藍(lán)納米粒（Prussian blue nanoparticles，PBNPs）對(duì)中空磁性 Fe3O4（hollow magnetic nanoparticle，HMNP）納米顆粒進(jìn)行包覆，研究其在近紅外激光輻照下的光熱轉(zhuǎn)換效率及由此產(chǎn)生對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的光熱殺傷作用，同時(shí)考察材料的 MRI/光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）/紅外熱成像（infrared thermal imaging，ITI）三重成像性能，制備出一種集多模態(tài)成像診斷和光熱治療一體化的多功能對(duì)比劑HMNP-PBNPs，在實(shí)施光熱治療的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)治療過程的可視化，提高治療的準(zhǔn)確性，并為后續(xù)臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料的設(shè)計(jì)制備過程及其光熱治療的作用機(jī)制見圖1。

圖1 三模態(tài)對(duì)比劑中空磁性Fe3O4-普魯士藍(lán)納米粒（HMNPPBNPs）的制備及其在808 nm近紅外光輻照下的腫瘤光熱消融作用

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 十五烷醇購(gòu)置于美國(guó)BOC Science公司，亞鐵氰化鉀、十二烷基磺酸鈉、苯乙烯、甲基丙烯酸、硝酸鉀和過硫酸鉀購(gòu)置于日本 TCI株式會(huì)社，其他常用化學(xué)試劑購(gòu)置于Alfa Aesar公司（中國(guó)）；人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰酶均購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；掃描電子顯微鏡（FEI Nova 400 Nano FEG-SEM，美國(guó)麥克里昂公司）、透射電子顯微鏡（LIBRA 200 FEG TEM，德國(guó)卡爾-蔡司股份公司）；紫外光譜儀（RF-6000，日本島津公司）。

1.2 HMNP-PBNPs的制備

1.2.1 聚苯乙烯微球的制備 首先通過乳液聚合法制備了表面羧基化的聚苯乙烯（PS）納米微球，并將其用作制備磁性中空微球的模板材料。將0.12 g十二烷基磺酸鈉、5.7 ml苯乙烯、15.0 ml甲基丙烯酸和0.25 g過硫酸鉀加入裝有100 ml去離子水的三頸燒瓶中，攪拌至充分溶解，將上述混合物加熱到75℃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用磁力攪拌器攪拌10 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液冷卻至室溫，以14000次/min將所得PS微球離心3 min進(jìn)行收集。

1.2.2 HMNP的制備 隨后將 1.0 ml PS微球溶液（5 wt%）稀釋在50 ml蒸餾水中，超聲10 min使顆粒充分分散，向溶液中加入氯化亞鐵（0.12 g）和氯化鐵（0.27 g）并充分混勻，然后加入1 ml乙二醇并超聲至各組分完全分散溶解。加入5.0 ml氨水和0.15 g鉀硝酸，將反應(yīng)體系加熱至80℃持續(xù)快速攪拌4 h，待反應(yīng)完成后將溶液冷卻至室溫。即可得磁性外殼包覆的聚苯乙烯納米顆粒（PS-MNP），將1.0 g PS-MNP顆粒置于600℃馬弗爐中燒結(jié)除去聚苯乙烯模板，即可得中空磁性納米顆粒（HMNP）。用雙蒸水和酒精將顆粒各洗滌8遍后儲(chǔ)存于80℃烘箱中。

1.2.3 HMNP-PBNPs的制備 將制備的 HMNP（25 ml，0.5 mg/ml）溶解于 K4[Fe(CN)6]（50 ml，50×10?3mol/L）溶液中，利用0.1 mol/L稀鹽酸將pH調(diào)至3，持續(xù)機(jī)械攪拌4 h后冷卻至室溫。利用磁鐵將所得普魯士藍(lán)包覆的磁性中空納米顆粒（HMNP-PBNPs）收集，用雙蒸水和酒精將顆粒各洗滌8遍后儲(chǔ)存于干燥箱中。取適量制備好的HMNP-PBNPs溶于蒸餾水中。利用紫外光譜儀測(cè)定材料的光學(xué)吸收性能；利用震動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)測(cè)量顆粒的磁學(xué)性能。

1.2.4 HMNP-PBNPs的產(chǎn)熱性能研究 用蒸餾水將HMNP-PBNPs配置為濃度分別為25、50、100、150、200 μg/ml的溶液，利用近紅外激光（808 nm，5 min，1.2 W/cm2）進(jìn)行照射，用紅外測(cè)溫儀記錄不同濃度HMNP-PBNPs溶液的產(chǎn)熱情況，并進(jìn)行6次“開-關(guān)”式循環(huán)產(chǎn)熱實(shí)驗(yàn)考察材料的光熱穩(wěn)定性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞（HepaG2）用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)箱條件：37℃，5%CO2），每2天換液1次。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 首先利用MTT法檢測(cè)納米顆粒對(duì)細(xì)胞活性的影響。將HepaG2細(xì)胞接種于96孔板上培養(yǎng)，其初始細(xì)胞密度為7.5×103個(gè)/cm2。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，將不同濃度的HMNP-PBNPs（25、50、100、150、200 μg/ml）添加到 96 孔板中（n=5），在37℃下培養(yǎng)24 h后利用近紅外激光輻照5 min，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，更換0.9 ml新鮮培養(yǎng)液并加入50 μl MTT溶液（2.0 mg/ml）。孵育3 h后，除去含有MTT的培養(yǎng)液，加入15 μl二甲亞砜以溶解結(jié)晶物甲臜。用酶標(biāo)儀（Bio Rad-680）在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組（生理鹽水+激光照射）、單純顆粒處理（HMNP）組以及光熱治療（HMNP+激光照射）組，利用MTT法和激光共聚焦考察HMNP-PBNPs在近紅外激光輻照下的細(xì)胞毒性及對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.5 體外多模態(tài)成像性能檢測(cè) 研究利用多種成像設(shè)備實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HMNP-PBNPs的體外成像性能。首先利用3T小動(dòng)物MRI系統(tǒng)檢測(cè)材料的T2-MRI成像性能；利用小動(dòng)物活體光熱聲成像儀（VecoLAZR，VisualSonics公司）測(cè)定不同濃度HMNP-PBNPs的光聲信號(hào)強(qiáng)度。利用紅外熱像儀（P20，F(xiàn)LIR-Systems公司）記錄不同濃度HMNP-PBNPs紅外熱成像特征。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用OriginPro 8.0軟件，計(jì)量資料兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMNP-PBNPs的理化性能表征 透射電鏡（圖2A）和掃描電鏡（圖2B）結(jié)果顯示：顆粒形狀為規(guī)則球形且呈現(xiàn)“核-殼”結(jié)構(gòu)特征，分散性良好，粒徑分布均勻，大小約為（131.7±11.6）nm，殼層厚度約為（18.5±3.5）nm。利用振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)系列顆粒的磁學(xué)性能：PS@MNP、HMNP、HMNP-PBNPs的磁強(qiáng)分別為25.6、38.6、36.6 emu/g（圖2C），說明HMNP-PBNPs納米顆粒具有良好的磁學(xué)性能，能夠作為MRI對(duì)比劑，其良好的磁學(xué)性能可以為腫瘤磁靶向治療提供可能。同時(shí)紫外吸收光譜分析結(jié)果顯示，HMNP-PBNPs的吸收峰在750 nm（圖2D），顯示材料在近紅外光區(qū)（700～1100 nm）具有較好的光學(xué)吸收性能，證實(shí)HMNP-PBNPs可以用作近紅外光熱納米制劑。

圖2 中空磁性Fe3O4-普魯士藍(lán)納米粒（HMNP-PBNPs）的理化性能表征。A為HMNP-PBNPs的透射電鏡圖；B為HMNP-PBNPs的掃描電鏡圖；C為磁性外殼包覆的聚苯乙烯納米顆粒（PS@MNP）、HMNP及HMNP-PBNPs的磁化強(qiáng)度；D為HMNP-PBNPs的紫外吸收光譜

2.2 HMNP-PBNPs的產(chǎn)熱性能表征 利用近紅外激光（808 nm，5 min，1.2 W/cm2）對(duì)不同濃度HMNP-PBNPs溶液（25、50、100、150、200 μg/ml）進(jìn)行照射，結(jié)果顯示，在顆粒濃度為200 μg/ml條件下，體系溫度在 5 min內(nèi)即可迅速升高至53.2℃，能夠滿足對(duì)腫瘤的光熱消融治療溫度需求（圖3A）。同時(shí)開展材料的光熱性能穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果顯示：HMNP-PBNPs具有優(yōu)良的重復(fù)使用光熱穩(wěn)定性，經(jīng) 6個(gè)循環(huán)的近紅外激光照射，材料的產(chǎn)熱效果未受明顯影響（圖 3B）；將 HMNPPBNPs放置3個(gè)月，其產(chǎn)熱性能同樣未見明顯變化（圖3C）。

圖3 中空磁性Fe3O4-普魯士藍(lán)納米粒（HMNP-PBNPs）的產(chǎn)熱性能表征。A為不同濃度HMNP-PBNPs的產(chǎn)熱性能；B為HMNPPBNPs的重復(fù)產(chǎn)熱性能；C為HMNP-PBNPs經(jīng)不同放置時(shí)間后的產(chǎn)熱性能

2.3 體外成像

2.3.1 MRI 在MRI T2WI模式下，雙蒸水對(duì)照組無MRI信號(hào)，而HMNP-PBNPs的MRI信號(hào)（黑色）隨濃度升高而逐漸增強(qiáng)（圖4A），200 μg/ml組與對(duì)照組相比，其信號(hào)值增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=16.5，P<0.05）?；貧w方程為：y=33.8x+1.76，R2=0.9987，具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 光聲成像 在光聲成像模式下，雙蒸水組基本無PAI成像信號(hào)，不同濃度梯度HMNP-PBNPs溶液在激光波長(zhǎng)為750 nm時(shí)出現(xiàn)較強(qiáng)的光聲信號(hào)，其PAI信號(hào)（紅色）隨濃度升高而增強(qiáng)（圖4B），200 μg/ml組與雙蒸水對(duì)照組相比，其信號(hào)值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=8.2，P<0.05）。

2.3.3 紅外熱成像 不同濃度梯度HMNP-PBNPs溶液在近紅外激光照射下能夠顯著升溫，隨溶液濃度的升高，其ITI成像信號(hào)也逐漸增大（圖4C），且其信號(hào)強(qiáng)度與HMNP-PBNPs濃度成正比，濃度越高，其ITI信號(hào)越強(qiáng)。

圖4 中空磁性Fe3O4-普魯士藍(lán)納米粒（HMNP-PBNPs）的多模態(tài)成像性能表征。A為不同濃度HMNP-PBNPs的MRI性能；B為不同濃度HMNP-PBNPs的PAI性能；C為不同濃度下HMNP-PBNPs的ITI性能

2.4 HMNP-PBNPs對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè) 利用MTT分析測(cè)定材料的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示：在未加載近紅外激光前，顆粒濃度為200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活性未受顯著影響（圖5A），而經(jīng)激光（808 nm，1.2 W/cm2，5 min）照射后，細(xì)胞增殖明顯抑制（圖5B），同生理鹽水組和加載顆粒未加激光輻照的對(duì)照組相比，光熱治療組在腫瘤增殖抑制>80%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。激光共聚焦結(jié)果顯示，HMNP-PBNPs共培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞形態(tài)：在未加載激光的情況下，細(xì)胞形態(tài)較好，未出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)性損壞；在經(jīng)近紅外激光照射后，細(xì)胞核的形態(tài)上呈典型的皺縮、壞死和凋亡特征（圖 5C），證實(shí)HMNP-PBNPs可在近紅外光輻照下有效熱殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖5 中空磁性Fe3O4-普魯士藍(lán)納米粒（HMNP-PBNPs）的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A為不同濃度HMNP-PBNPs對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用（n=5）；B為不同濃度HMNP-PBNPs經(jīng)近紅外激光輻照（激光器功率：808 nm，1.2 W/cm2，5 min）對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用（n=5）；C為共聚焦激光顯微鏡驗(yàn)證光熱治療（激光參數(shù)：808 nm，1.2 W/cm2，5 min）前后細(xì)胞形態(tài)特征，圖中標(biāo)記細(xì)胞核的藍(lán)色熒光染料為Hoechst 33258，標(biāo)尺為50 μm

3 討論

近紅外光介導(dǎo)的光熱治療是腫瘤精準(zhǔn)化治療的一種新手段，由于其近紅外光具有組織穿透性好、產(chǎn)熱區(qū)域集中、小型化設(shè)備便于攜帶等特點(diǎn)，引起腫瘤臨床診療研究的廣泛關(guān)注[6]。研究人員開發(fā)了各種具有近紅外光吸收特性的納米制劑，并用于惡性腫瘤的光熱消融治療[7]，包括金基納米結(jié)構(gòu)如金納米球、金納米棒及金納米殼等[8-9]，鉑基納米結(jié)構(gòu)如鉑凹面納米框架[10]，碳基納米結(jié)構(gòu)如碳納米管和石墨烯等[11-12]，銅硫半導(dǎo)體基納米結(jié)構(gòu)[13]，以及有機(jī)類納米材料如吲哚菁綠等[14-15]。本研究選用FDA認(rèn)證的磁性Fe3O4和PB納米顆粒為基礎(chǔ)構(gòu)建近紅外光熱納米診療劑HMNP-PBNPs，開發(fā)一種近紅外光引導(dǎo)的惡性腫瘤光熱消融治療。同時(shí)文中基于磁性Fe3O4的強(qiáng)磁性材料的設(shè)計(jì)，能夠在外磁場(chǎng)作用下有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤部位的磁導(dǎo)向遞送和精確靶向治療[16]。

與此同時(shí)，由于HMNP-PBNPs中的Fe3O4存在，使其具有優(yōu)良的磁學(xué)性能，使其可能被開發(fā)為一種T2加權(quán)增強(qiáng)MRI對(duì)比劑[17]。此外，HMNP-PBNPs還具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能，將其開發(fā)為光聲成像對(duì)比劑，可用于腫瘤部位的精準(zhǔn)示蹤，增強(qiáng)治療過程的精確度，提高治療過程的安全性。同時(shí)采用近紅外熱成像記錄腫瘤部位的實(shí)時(shí)溫度變化情況，由此構(gòu)建一種MRI/PAI/ITI三模態(tài)成像的腫瘤診斷治療一體化多功能載體平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)腫瘤光熱消融治療的同時(shí)，利用分子影像診斷保障了治療過程的可視化和可靠性。

總之，本研究成功設(shè)計(jì)制備一種新型診療一體化近紅外光熱納米制劑 HMNP-PBNPs，該材料具有高效的光熱轉(zhuǎn)換效率和光熱穩(wěn)定性，能夠在MRI/PAI/ITI多模態(tài)成像介導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)腫瘤的有效光熱消融，提高治療效果和治療過程的安全性，具有較好的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化潛力。本研究的局限性為：未評(píng)價(jià)材料的血液相容性和組織相容性，體內(nèi)成像研究尚未深入探討，HMNP-PBNPs在體內(nèi)是否能在外加磁場(chǎng)的作用下靶向定位至腫瘤部位并有效蓄積，以及是否能夠充分熱消融體內(nèi)實(shí)體瘤，材料在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及代謝途徑等均有待進(jìn)一步證實(shí)。因此，尚需開展深入的體內(nèi)成像及實(shí)體瘤治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。