張曉奇，張容亮，孫月，陸永萍

昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，云南省第二人民醫(yī)院超聲科，云南昆明 650021；

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后對(duì)心肌微循環(huán)的評(píng)估可預(yù)測(cè)患者預(yù)后，心肌聲學(xué)造影（myocardial contrast echocardiography，MCE）采用的對(duì)比劑微泡與紅細(xì)胞有相似的流變能力，可用于評(píng)估心肌微血管灌注的程度[1]。炎癥反應(yīng)參與心肌梗死的整個(gè)過程。AMI后，心肌缺血及壞死部位會(huì)釋放多種炎性細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）是參與其中的重要細(xì)胞因子之一[2]，其中 IL-8具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、刺激血管生成等作用[3]。本研究采用SonoVue對(duì)比劑耦聯(lián)IL-8單抗后形成靶向?qū)Ρ葎?，?duì)心肌梗死兔模型行 MCE檢查，對(duì)比單純使用SonoVue對(duì)比劑，對(duì)兔心肌梗死后心肌微循環(huán)灌注進(jìn)行定量分析，評(píng)價(jià)攜 IL-8單抗對(duì)比劑的特異性靶向功能，使MCG能夠更準(zhǔn)確、更早期地診斷缺血性心臟病，為定量分析、評(píng)估心肌灌注提供一種無創(chuàng)且更加精準(zhǔn)的方法。

1 材料與方法

1.1 制備動(dòng)物模型 選取健康成年日本大耳白兔30只[由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證SCXK（滇）2011-0004]，體重2.7～3.5 kg，雌雄不限，體健毛光。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法，將30只兔排號(hào)，通過抽簽的方式隨機(jī)分為AMI組和假手術(shù)組，每組15只。AMI組：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制作左心室前壁、前間隔心肌梗死模型；假手術(shù)組：同一結(jié)扎點(diǎn)只穿線不結(jié)扎，其他操作均與AMI組相同。具體操作見既往研究[4]。

1.2 制備攜IL-8單抗的靶向?qū)Ρ葎?采用共價(jià)耦聯(lián)法通過SPDP交聯(lián)劑將IL-8單抗耦聯(lián)于SonoVue微泡表面，制備靶向超聲對(duì)比劑[5]。

1.3 對(duì)動(dòng)物模型行常規(guī)心臟超聲檢查及 MCE檢查采用Philips iE33型超聲診斷儀，心臟探頭型號(hào)S5-1，頻率為1.8/3.6 MHz。將各組兔分別于術(shù)前、術(shù)后30 min、2 h及6 h行常規(guī)心臟超聲檢查、SonoVue對(duì)比劑及攜IL-8單克隆抗體靶向?qū)Ρ葎㎝CE檢查。各組兔每次完成常規(guī)心臟超聲檢查后，啟動(dòng)造影程序，每次抽取0.15 ml SonoVue對(duì)比劑，經(jīng)兔耳緣靜脈團(tuán)注，然后立即使用1 ml生理鹽水沖注，重點(diǎn)觀察造影時(shí)左心室短軸乳頭肌水平各節(jié)段心肌的超聲圖像變化，記錄開始顯影時(shí)間，待心肌顯影穩(wěn)定后，通過觸發(fā)高能量脈沖（Flash閃爍）對(duì)心肌組織內(nèi)的對(duì)比劑進(jìn)行破泡，觀察儀器自動(dòng)轉(zhuǎn)換成低能量實(shí)時(shí)造影過程中對(duì)比劑再充盈情況，儲(chǔ)存檢查過程中的全部動(dòng)靜態(tài)圖像，應(yīng)用QLAB 8.0軟件，在左心室乳頭肌水平短軸切面上選取前間隔、前壁、下壁和后間隔 4個(gè)節(jié)段作為主要分析節(jié)段（因?qū)Ρ葎┪⑴葸M(jìn)入左心腔后，側(cè)壁及后壁受到聲衰減影響，故而不列入研究節(jié)段），對(duì)充盈影像進(jìn)行脫機(jī)分析，分析過程中，所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物命名只用編號(hào)，不標(biāo)明分組。設(shè)定感興趣區(qū)域后，以Flash后第一幀為起點(diǎn)，繪制感興趣區(qū)域心肌對(duì)比劑灌注的時(shí)間-強(qiáng)度曲線（time-intensity curve，TIC）。軟件可計(jì)算出感興趣區(qū)域的超聲均值、超聲峰值、達(dá)峰時(shí)間、超聲中值等，本實(shí)驗(yàn)選取超聲均值、達(dá)峰時(shí)間、開始顯影時(shí)間作為研究指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。同一樣本進(jìn)行2次不同處理，用配對(duì)t檢驗(yàn)；2個(gè)不同樣本進(jìn)行相同處理，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多個(gè)樣本比較采用方差分析。等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備情況 30只模型兔在實(shí)驗(yàn)過程中，假手術(shù)組死亡2只，其中1只在開胸后立即死亡，原因可能是麻醉過量引起呼吸衰竭、死亡；另1只術(shù)中因胸膜破裂致呼吸衰竭死亡；AMI組死亡5只，其中2只為術(shù)中胸膜破裂致呼吸衰竭死亡，另外3只分別于結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后約15 min、1 h及3 h后死亡，可能與手術(shù)操作不當(dāng)、麻醉不當(dāng)、心肌梗死面積過大、動(dòng)物模型本身等因素有關(guān)。

2.2 QLAB定量分析 以開始注射對(duì)比劑為起點(diǎn)，2種對(duì)比劑 AMI組各節(jié)段心肌對(duì)比劑視頻強(qiáng)度的超聲均值見表1。

表1 AMI組各節(jié)段心肌對(duì)比劑視頻強(qiáng)度的超聲均值比較（ ±s，dB）

表1 AMI組各節(jié)段心肌對(duì)比劑視頻強(qiáng)度的超聲均值比較（ ±s，dB）

注：與術(shù)前比較，*P<0.05；與下壁比較，#P<0.05；與后間隔比較，&P<0.05

術(shù)后 2 h（n=11） SonoVue 4.91±0.95*# 4.96±1.05*& 14.87±1.44 15.02±1.87 IL-8靶向8.78±1.30*#8.99±0.99*&18.26±2.37*18.49±2.31*術(shù)后6 h（n=10）SonoVue 5.09±1.25*#5.20±1.11*&15.46±1.7815.03±1.83 IL-8靶向9.52±1.13*#9.32±1.39*&18.45±2.23*18.65±2.14*

各節(jié)段心肌超聲均值比較：術(shù)后30 min、2 h及6 h，AMI組兩造模節(jié)段（前壁及前間隔）的對(duì)比劑超聲均值低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；前壁與下壁之間比較，術(shù)后30 min、2 h及6 h，前壁的對(duì)比劑超聲均值低于下壁，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；前間隔與后間隔之間比較，術(shù)后30 min、2 h及6 h，前間隔的對(duì)比劑超聲均值低于后間隔，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

對(duì)比SonoVue對(duì)比劑及攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎盒g(shù)前兩者前壁、前間隔、后間隔、下壁的對(duì)比劑超聲均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而術(shù)后30 min、2 h及6 h，攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎﹥稍炷９?jié)段（前壁及前間隔）的對(duì)比劑超聲均值均高于SonoVue對(duì)比劑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，在術(shù)后30 min、2 h及6 h，后間隔、下壁的攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┏暰蹈哂谛g(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而SonoVue對(duì)比劑術(shù)前、術(shù)后超聲均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

以開始注射對(duì)比劑為起點(diǎn)，假手術(shù)組2種對(duì)比劑前壁和前間隔心肌對(duì)比劑視頻強(qiáng)度的超聲均值見表2。術(shù)后30 min、2 h及6 h，AMI組前壁及前間隔的對(duì)比劑超聲均值均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 假手術(shù)組兔造模節(jié)段心肌對(duì)比劑視頻強(qiáng)度的超聲均值比較（ ±s，dB）

表2 假手術(shù)組兔造模節(jié)段心肌對(duì)比劑視頻強(qiáng)度的超聲均值比較（ ±s，dB）

節(jié)段對(duì)比劑術(shù)前術(shù)后30 min 術(shù)后2 h 術(shù)后6 h前壁SonoVue 14.54±1.6814.54±1.7014.66±1.9014.49±1.61 IL-8靶向15.08±1.7814.61±1.5214.34±1.7614.48±2.04前間隔SonoVue 15.02±1.5914.64±1.9414.47±2.0514.57±1.98 IL-8靶向14.93±1.9014.43±1.9914.97±1.9414.47±1.68

2.3 AMI組造模節(jié)段2種對(duì)比劑達(dá)峰時(shí)間和開始顯影時(shí)間比較 以Flash第一幀為起點(diǎn)，對(duì)AMI組造模節(jié)段對(duì)比劑達(dá)峰時(shí)間比較，術(shù)后30 min、2 h及6 h，IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎〢MI組2個(gè)造模節(jié)段（前壁及前間隔）的靶向?qū)Ρ葎┻_(dá)峰時(shí)間早于 SonoVue對(duì)比劑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 2種對(duì)比劑、AMI組造模節(jié)段對(duì)比劑的達(dá)峰時(shí)間比較（±s，s）

表3 2種對(duì)比劑、AMI組造模節(jié)段對(duì)比劑的達(dá)峰時(shí)間比較（±s，s）

注：與SonoVue對(duì)比劑比較，*P<0.05

對(duì)比劑節(jié)段對(duì)比劑達(dá)峰時(shí)間術(shù)前術(shù)后30 min 術(shù)后2 h 術(shù)后6 h SonoVue 前壁0.62±0.100.96±0.110.95±0.080.93±0.10前間隔 0.63±0.11 0.94±0.10 0.95±0.09 0.92±0.09 IL-8靶向前壁0.67±0.100.44±0.09*0.45±0.10*0.45±0.09*前間隔0.68±0.100.45±0.10*0.45±0.09*0.46±0.09*

以開始注射對(duì)比劑為起點(diǎn)，對(duì)AMI組造模節(jié)段心肌開始顯影時(shí)間比較，術(shù)后30 min、2 h及6 h，AMI組2個(gè)造模節(jié)段（前壁及前間隔）的攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎╅_始顯影時(shí)間明顯早于 SonoVue對(duì)比劑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4及圖1～4。

表4 2種對(duì)比劑、AMI組造模節(jié)段對(duì)比劑開始顯影時(shí)間比較（±s，s）

表4 2種對(duì)比劑、AMI組造模節(jié)段對(duì)比劑開始顯影時(shí)間比較（±s，s）

注：與SonoVue對(duì)比劑比較，*P<0.05

對(duì)比劑節(jié)段對(duì)比劑開始顯影時(shí)間術(shù)前術(shù)后30 min 術(shù)后2 h 術(shù)后6 h SonoVue 前壁12.65±0.5215.87±0.7915.37±0.7215.01±0.52前間隔 12.66±0.67 16.10±0.75 15.39±0.80 15.21±0.56 IL-8靶向前壁16.89±0.9711.03±0.67*11.31±0.70*11.56±0.65*前間隔16.79±0.9911.07±0.78*11.19±0.72*11.61±0.67*

圖1 攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┘偈中g(shù)組和AMI組心肌各節(jié)段對(duì)比劑充盈的時(shí)間-強(qiáng)度曲線（TIC）。假手術(shù)組前壁、前間隔、后間隔及下壁4個(gè)不同節(jié)段的曲線走行及水平相近，AMI組前壁、前間隔2個(gè)節(jié)段的曲線水平明顯低于后間隔和下壁

圖2 SonoVue對(duì)比劑：假手術(shù)組術(shù)后30 min心肌顯影過程

圖3 SonoVue對(duì)比劑：AMI組術(shù)后30 min心肌顯影過程

圖4 術(shù)后30 min假手術(shù)組、AMI組攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎ˋ為假手術(shù)組，B為AMI組）及SonoVue對(duì)比劑（C為假手術(shù)組，D為AMI組）充盈初期，AMI組攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┘纯梢妼?duì)比劑充盈，其余未見明顯對(duì)比劑充盈

3 討論

近年來，超聲靶向微泡造影技術(shù)逐漸成熟，已成為國(guó)內(nèi)外超聲診斷、治療研究的熱點(diǎn)。既往MCE檢查中，SonoVue是較為常用的對(duì)比劑，而在AMI過程中常伴隨組織壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。IL-8是一種具有強(qiáng)血管生成特性的炎性趨化因子[6]，在心肌梗死缺血壞死部位高表達(dá)，通過在普通超聲微泡表面裝配具有炎癥靶向性的特異配體（IL-8單抗），可構(gòu)建成能與急性心肌梗死炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域靶向結(jié)合的靶向性超聲微泡，對(duì)該區(qū)域有更好的顯像效果。

心肌微循環(huán)灌注在AMI期間有非常重要的意義。普通的冠狀動(dòng)脈造影往往針對(duì)的是冠狀動(dòng)脈形態(tài)學(xué)檢查，僅限于直徑＞100 μm的冠狀動(dòng)脈，而MCE能夠有效顯示直徑＜100 μm的微血管，可評(píng)估心肌血流灌注情況[7]。本實(shí)驗(yàn)使用SonoVue對(duì)比劑及攜IL-8單抗的靶向?qū)Ρ葎┬蠱CE時(shí)，對(duì)于同一實(shí)驗(yàn)兔，AMI組2個(gè)造模節(jié)段（前壁及前間隔）的對(duì)比劑超聲均值均低于術(shù)前、非梗死區(qū)、假手術(shù)組，證實(shí)MCE定量評(píng)價(jià)心肌梗死區(qū)域的可靠性。AMI組在術(shù)后30 min、2 h及6 h，后間隔、下壁的攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┏暰蹈哂谛g(shù)前（P<0.05），而SonoVue對(duì)比劑則沒有這種現(xiàn)象。這是由于 AMI激活心肌內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致全身性的炎癥變化[8]，后間隔及下壁同樣會(huì)有的炎性因子浸潤(rùn)，因此會(huì)表現(xiàn)出顯影較術(shù)前更明顯的現(xiàn)象，是攜 IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┡c炎性因子IL-8之間存在靶向性的又一證明。

同時(shí)，AMI組2個(gè)造模節(jié)段（前壁及前間隔）的攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┏暰稻哂赟onoVue對(duì)比劑，且攜IL-8單抗對(duì)比劑的顯影時(shí)間和達(dá)峰時(shí)間均早于SonoVue對(duì)比劑，反映了IL-8單克隆抗體與缺血心肌釋放的炎性因子IL-8之間的靶向性，攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎┛梢蕴禺惖丶塾谌毖募?nèi)，與炎性因子結(jié)合、顯影，其顯影效果和速度優(yōu)于普通SonoVue對(duì)比劑。兔在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后造模節(jié)段的微循環(huán)會(huì)顯著減少，而側(cè)支循環(huán)的建立需要時(shí)間，MCE結(jié)果本應(yīng)表現(xiàn)為充盈較差甚至充盈缺損，但實(shí)驗(yàn)過程中，AMI組術(shù)后應(yīng)用攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎?0 min即表現(xiàn)出造模節(jié)段對(duì)比劑充盈明顯強(qiáng)于SonoVue對(duì)比劑，充盈速度快于SonoVue對(duì)比劑。因此，在AMI早期（術(shù)后30 min），造模節(jié)段的炎性因子IL-8明顯升高。因此，心肌缺血可行攜帶 IL-8單抗的靶向?qū)Ρ葎?MCE檢查，其效果優(yōu)于普通SonoVue對(duì)比劑MCE檢查，在識(shí)別梗死區(qū)域方面有較大優(yōu)勢(shì)，為診斷缺血性心臟病提供了一種更早期、更精準(zhǔn)的方法。

本研究的局限性為：首先，由于所用超聲儀器使用了成人心臟超聲探頭，型號(hào)為S5-1，頻率過低（頻率僅1.8/3.6 MHz），觀察兔心臟的分辨率相對(duì)較差，圖像質(zhì)量較低，會(huì)影響研究圖像的精確性；這個(gè)可通過將來研究中更換更高頻率的心臟超聲探頭進(jìn)行改善。其次，本研究由于對(duì)比劑微泡進(jìn)入左心腔后，側(cè)壁及后壁受到聲衰減影響，僅能觀察前間隔、左心室前壁、下壁、后間隔，無法觀察左心室側(cè)壁、后壁。因此觀察不夠全面，這也是超聲二維成像本身的局限性，鄭智超等[7]的研究顯示，與普通的二維 MCE檢查相比，聲學(xué)造影RT-3DE成像可以更立體、更全面地對(duì)各室壁顯像，此方法可以在后續(xù)研究中加以運(yùn)用。靶向?qū)Ρ葎y帶的 IL-8單抗可與心肌缺血區(qū)域的IL-8特異性結(jié)合、顯影，其對(duì)心肌微循環(huán)灌注研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎㎝CE檢查可對(duì)缺血性心臟病提供更早、更精確的診斷方法，是目前較為理想的方法。此外，攜IL-8單抗靶向?qū)Ρ葎?duì)缺血心肌部位 IL-8的靶向性為今后心肌缺血早期從細(xì)胞及分子水平進(jìn)行診斷、治療提供了新的思路，隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，本課題組也將對(duì)超聲微泡的靶向治療進(jìn)行更深層次的研究。