胡根文，全顯躍，李欣明，梅穎潔，符式新，張凱鐘

1.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院影像中心，廣東深圳 518133；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院影像中心，廣東廣州 510282；3.飛利浦醫(yī)療保健事業(yè)部，廣東廣州 510282；

肝纖維化是肝組織對(duì)各種病因的慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)。早期的纖維化具有可逆性[1]，通過(guò)適當(dāng)?shù)闹委熆梢宰柚够蜓泳徠溥M(jìn)展為肝硬化及肝癌[2]。傳統(tǒng)影像檢查方法對(duì)肝纖維化的診斷準(zhǔn)確性不足。擴(kuò)散加權(quán)成像（DWI）反映了水分子在組織中的布朗運(yùn)動(dòng)，可以間接反映組織微結(jié)構(gòu)的變化。單指數(shù)模型擴(kuò)散成像是基于水分子的高斯擴(kuò)散的特性而獲得 ADC值[3]。拉伸指數(shù)模型（stretched exponential model，SEM）擴(kuò)散成像等非高斯擴(kuò)散模型可能提供關(guān)于體內(nèi)實(shí)際水分子運(yùn)動(dòng)更準(zhǔn)確的信息[4]。本研究擬探討單指數(shù)及拉伸指數(shù)模型擴(kuò)散成像診斷肝纖維化大鼠模型病理分期的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得40只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重（250±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為 44007200041126。在無(wú)特定病原體級(jí)環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。室溫18～20℃，濕度60%～70%。12 h光照、黑暗交替。所有的實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)過(guò)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)為B201706-11）。

大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組 8只、模型組32只。用3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射（0.2 ml/100 g）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。無(wú)菌技術(shù)下行腹部切口，分離膽總管并在分叉處緊鄰肝臟進(jìn)行結(jié)扎。為了獲得纖維化各個(gè)階段的數(shù)據(jù)，在術(shù)后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（7、14、21、28 d）采用隨機(jī)數(shù)字表法選取8只大鼠進(jìn)行MRI及病理檢查。

1.2 儀器與方法 采用Philips Ingenia 3.0T MR掃描儀，4通道小動(dòng)物線(xiàn)圈。大鼠用3%戊巴比妥腹腔內(nèi)注射，劑量為 0.2 ml/100 g，以俯臥位、頭先進(jìn)進(jìn)行掃描。掃描序列：①軸面梯度回波T2WI：TR 206 ms，TE 9.2 ms，視野60 mm×60 mm，矩陣100×100，層厚3 mm；②軸面快速自旋回波T1WI：TR 400 ms，TE 10 ms，視野60 mm×60 mm，矩陣120×93，層厚3 mm；③DWI采用平面回波序列，TR 2000 ms，TE 55 ms，視野50 mm×50 mm，層厚3 mm，層數(shù)9，矩陣64×63，單指數(shù)模型b值為0、800 s/mm2；拉伸指數(shù)模型b值為 0、700、1400、2100 s/mm2。

1.3 圖像分析 將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件PRIDE DWI Tool 1.5（Philips Healthcare Best），經(jīng) Levenberg-Marquardt算法進(jìn)行擬合，①傳統(tǒng)的單指數(shù)擴(kuò)散模型為[5]：Sb/S0=exp（-b·ADC），其中Sb和S0分別是b≠0和 b=0時(shí)的擴(kuò)散加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度，ADC是表觀擴(kuò)散系數(shù)；②拉伸指數(shù)模型為[6]：ln（S）=ln（S0）－（b·DDC）α，其中DDC表示分布擴(kuò)散系數(shù)，α表示水分子擴(kuò)散異質(zhì)性指數(shù)（0～1）。

獲得參數(shù)（ADC、DDC、α）圖后，由2名醫(yī)師在不知曉病理結(jié)果的情況下使用 Image J軟件（National Institutes of Health）在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)手動(dòng)勾畫(huà)5個(gè)感興趣區(qū)，大小3～4 mm2，避免包含肝緣、血管或膽管，測(cè)量各參數(shù)值。

1.4 病理分析 掃描結(jié)束后處死大鼠，取出肝組織固定、切片，行HE及Masson染色。參照METAVIR分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，將肝纖維化分為F0～4期，F(xiàn)0期：無(wú)纖維化；F1期：匯管區(qū)及其周?chē)w維化和局限竇周纖維化；F2期：纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)大部仍保留；F3期：大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，但尚無(wú)肝硬化；F4期：肝硬化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。各參數(shù)結(jié)果與病理分期的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理表現(xiàn) 對(duì)照組8只均無(wú)纖維化，均為F0期。模型組F1期8只、F2期9只、F3期9只、F4期6只（圖1）。

圖1 大鼠肝臟Masson染色病理結(jié)果（×200）。A為對(duì)照組大鼠肝臟病理圖，無(wú)纖維化；B為F1期，匯管區(qū)及其周?chē)w維化和局限竇周纖維化；C為F2期，纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)大部仍保留；D為F3期，大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，但尚無(wú)肝硬化；E為F4期，肝硬化

2.2 MRI表現(xiàn) 所有動(dòng)物均完成MRI檢查（圖2）。不同肝纖維化病理分期（F1～F4期）各組大鼠的ADC、DDC、α均低于對(duì)照組（F0期），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且不同纖維化分級(jí)之間的參數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），見(jiàn)表1。纖維化分期與單指數(shù)及拉伸指數(shù)參數(shù)（ADC、DDC、α）均具有相關(guān)性（r=-0.734、-0.792、0.505，P均<0.05）。

圖2 膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化F3期大鼠MRI圖像。A為軸面T1WI像；B為軸面T2WI像；C為單指數(shù)擬合的ADC圖；D為拉伸指數(shù)擬合的分布擴(kuò)散系數(shù)（DDC）圖；E為拉伸指數(shù)擬合的水分子擴(kuò)散異質(zhì)性指數(shù)（α）圖

表1 不同病理分期肝纖維化組的單指數(shù)及拉伸指數(shù)模型參數(shù)比較（ ±s）

表1 不同病理分期肝纖維化組的單指數(shù)及拉伸指數(shù)模型參數(shù)比較（ ±s）

注：DDC：分布擴(kuò)散系數(shù)；α：水分子擴(kuò)散異質(zhì)性指數(shù)

F2 期 9 0.921±0.080 0.773±0.125 0.693±0.082 F3期90.838±0.0780.700±0.0750.700±0.059 F4 期 6 0.831±0.099 0.681±0.072 0.667±0.085 F值30.6821.525.80 P值 <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

膽管結(jié)扎法建立大鼠肝纖維化模型是通過(guò)人為肝外膽道阻塞，引發(fā)膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力增高、膽管擴(kuò)張，并可引起肝內(nèi)膽小管破裂。由于肝內(nèi)血管受到擴(kuò)張膽管的壓迫可造成肝細(xì)胞的缺氧，同時(shí)膽汁外滲，可引起肝細(xì)胞壞死及膠原組織沉積，纖維組織增生并向膽管伸展，包圍肝小葉并散布于肝細(xì)胞周?chē)S著肝纖維化的加深，最終可以形成肝硬化。因該模型炎癥反應(yīng)少，纖維化形成快，自發(fā)逆轉(zhuǎn)率低，安全無(wú)毒，是肝纖維化較理想的模型之一，適合于模擬臨床膽汁性肝硬化的研究[8]。

MR擴(kuò)散成像是一種功能MRI技術(shù)，反映組織內(nèi)水分子布朗運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)，從而間接反映組織微觀結(jié)構(gòu)的變化[9]。在均質(zhì)中，水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)形式分布函數(shù)呈高斯分布，即是自由、非受限的。傳統(tǒng)的ADC值即是在這種假定下通過(guò)單指數(shù)高斯擴(kuò)散模型來(lái)分析組織結(jié)構(gòu)差異[3]。然而，由于組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，存在特殊細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜屏障、細(xì)胞內(nèi)外間隔等各種擴(kuò)散屏障，所以體內(nèi)水?dāng)U散行為不可能完全符合高斯模型的自由擴(kuò)散，非高斯擴(kuò)散模型能更準(zhǔn)確地反映組織內(nèi)真實(shí)的水分子擴(kuò)散情況[10]。

拉伸指數(shù)模型擴(kuò)散成像是新興的非高斯擴(kuò)散模型成像，可同時(shí)提供組織的非高斯擴(kuò)散信息及組織的異質(zhì)性程度，拉伸指數(shù)模型擴(kuò)散成像有參數(shù)DDC（與標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)散系數(shù)相似）和參數(shù)α。α接近于1表示組織內(nèi)擴(kuò)散的異質(zhì)性低，而接近于0的α表示高度異質(zhì)性[6]。

既往研究結(jié)果顯示[11-13]，在肝纖維化發(fā)展后ADC下降。本研究中，參數(shù)ADC、DDC隨著纖維化水平的增加而下降。一般認(rèn)為是由于肝纖維化過(guò)程中，肝臟損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、凋亡和炎癥，可能導(dǎo)致各種細(xì)胞因子和脂質(zhì)過(guò)氧化物的分泌，共同作用于肝星狀細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。ECM 沉積以及肝細(xì)胞液體的滲漏和肝纖維化過(guò)程中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等因素均可以限制水分子擴(kuò)散并導(dǎo)致擴(kuò)散參數(shù) ADC、DDC降低。

DDC與肝纖維化分級(jí)之間的相關(guān)性?xún)?yōu)于ADC，這可能是由于各種擴(kuò)散障礙如ECM、炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和脂肪變性的存在，肝內(nèi)水分子的擴(kuò)散已經(jīng)偏離高斯模型。以非高斯模型獲得的DDC與肝纖維化組織擴(kuò)散的實(shí)際狀態(tài)更為一致。

α反映了微觀結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性[6]，認(rèn)為其在膠質(zhì)瘤分級(jí)中有較強(qiáng)的參考價(jià)值[14]，在鑒別腎臟腫瘤時(shí)也有一定的意義[15]。Anderson等[16]報(bào)道了 α在肝纖維化中的變化，并且認(rèn)為α與病理分級(jí)關(guān)系不密切，但是該報(bào)告是基于離體肝臟的研究。本活體研究表明，與正常肝組織相比，α在纖維化中呈增加趨勢(shì)，表明肝纖維化過(guò)程中，病變呈彌漫性改變，但其微觀組織異質(zhì)性并未增高。

本研究通過(guò)大鼠模型分析了肝纖維化中單指數(shù)及拉伸指數(shù)模型擴(kuò)散成像的變化規(guī)律及各參數(shù)反映相應(yīng)組織病理和生理變化，表明拉伸指數(shù)模型擴(kuò)散成像能更好地反映組織在超高b值下的水?dāng)U散特性，并包含有組織內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)的特定信息，可作為標(biāo)準(zhǔn)DWI單指數(shù)模型的補(bǔ)充手段。然而，因本研究?jī)H涉及動(dòng)物模型，并且樣本量較小，拉伸指數(shù)模型擴(kuò)散成像的臨床應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)一步研究。