施吉祥，朱菁，徐希明，余江南

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

麥冬多糖(Ophiopogon japonicas polysaccharide,OJP)是從植物麥冬的塊根中提取的水溶性多糖，來源廣泛，藥理活性強(qiáng)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷等活性[1-5]。此外，麥冬多糖良好的降血糖效果且毒副反應(yīng)小等優(yōu)勢使其得到廣泛關(guān)注。然而，天然麥冬多糖由于親水性高，半衰期短且易被體內(nèi)的酸、堿或酶破壞，使其失去活性，因此口服生物利用度很低，不能在體內(nèi)發(fā)揮預(yù)期的治療效果，嚴(yán)重限制了OJP的臨床應(yīng)用。

多糖屬于水溶性好的大分子類物質(zhì)，多囊脂質(zhì)體(multivesicular liposomes,MVLs)特別適合水溶性的小分子和生物大分子(蛋白、多肽等)的傳遞，是采用貯庫泡沫技術(shù)的一種新型脂質(zhì)體(1～100 μm)，內(nèi)部是由多個含水腔室以非同心圓的形式構(gòu)成的，各水性腔室之間又以類脂雙分子層磷脂膜相隔[6]，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得其在體內(nèi)外都有較高的穩(wěn)定性。多囊脂質(zhì)體通常具有較大的粒徑與更大的包封容積，其較大的內(nèi)水相空間彌補(bǔ)了普通脂質(zhì)體對親水性藥物包封率低的問題[7]。不連續(xù)的多囊泡結(jié)構(gòu)使得其具有良好的穩(wěn)定性與緩釋效果，當(dāng)某個囊泡破裂時，藥物僅從該囊泡釋放出來，而脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)仍然可以保持完整，因此藥物釋放緩慢，穩(wěn)定性高[8]，是一種很有前景的天然多糖藥物傳遞系統(tǒng)。

本文通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法篩選出包封率最高的麥冬多糖多囊脂質(zhì)體(OJP-MVLs)的處方，并對其進(jìn)行體外表征和穩(wěn)定性試驗(yàn)。通過建立2型糖尿病小鼠模型，比較麥冬多糖及其多囊脂質(zhì)體抗2型糖尿病的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

四川麥冬(河北神橋農(nóng)業(yè)科技有限公司)；膽固醇、三油酸甘油酯、Tween 80、葡萄糖、賴氨酸、維生素E、檸檬酸、檸檬酸三鈉以及二氯甲烷、乙醚、甲醇等分析純試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DOPC、DOPG(德國Lipoid公司)；高糖高脂飼料(江蘇協(xié)同生物工程有限公司)；鏈脲佐菌素(上海源葉生物科技有限公司)；鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團(tuán))；胰島素ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 動物及飼養(yǎng)條件

昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。每10只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(20±2)°C，自由供食供水，每12 h光暗交替。

1.3 OJP的制備

取粉碎的四川麥冬200 g，用蒸餾水提取，料液比為1∶12，提取溫度為100℃，提取2次，每次4 h，離心10 min (3 000 r/min)后，棄去藥渣，收集濾液。所收集的濾液經(jīng)減壓濃縮至100 mL以內(nèi)，加5倍量的95%乙醇，醇沉過夜，離心10 min(3 000 r/min)后收集沉淀。沉淀物用水復(fù)溶后，加入20%三氯乙酸溶液使體系中三氯乙酸最終濃度為7%，離心30 min(10 000 r/min)除去蛋白沉淀，收集上清液并用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，減壓濃縮后，裝入透析袋中(截留分子量為3 500 Da)，在蒸餾水中透析4天，勤換水。合并濃縮，凍干得四川麥冬多糖。用苯酚-濃硫酸法測得多糖含量為99.83%。

1.4 OJP-MVLs的制備與表征

1.4.1 OJP-MVLs的制備方法

采用復(fù)乳法制備麥冬多糖多囊脂質(zhì)體(OJP-MVLs)。稱取一定量的DOPC、DPPG、膽固醇、三油酸甘油酯和維生素E溶解于1 mL的有機(jī)溶劑中，攪拌使其完全溶解，形成油相，加入到同等體積的溶有一定質(zhì)量麥冬多糖(OJP)的4.5 %(w/v)葡萄糖溶液(內(nèi)水相)中，高速剪切(9 000 r/min,10 min)使之形成穩(wěn)定的W/O型乳液(初乳)。再制備3 mL含有一定量Tween 80，4.0%(w/v)葡萄糖溶液，40 mmol/L賴氨酸的外水相。在磁攪拌的條件下，將初乳注入到外水相中，形成W/O/W型復(fù)乳，置于37℃的恒溫水浴鍋中并通氮?dú)獬ビ袡C(jī)溶劑，直至完全去除，并將其分散到生理鹽水中，得到麥冬多糖多囊脂質(zhì)體。

1.4.2 OJP-MVLs包封率的測定

采用苯酚-硫酸法測定麥冬多糖多囊脂質(zhì)體包封率。計(jì)算公式如下：

包封率(%)=(C藥/ C總)×100%

其中C藥為包封于脂質(zhì)體中的藥物量；C總為脂質(zhì)體中包封的多糖與游離多糖之和。

1.4.3 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化處方

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則[9]，考察各因素間的交互作用，對處方進(jìn)行優(yōu)化，藥脂比為1:1，即24 mg 麥冬多糖和24 mg的磷脂(其中DOPC 20 mg，DPPG 4 mg)，維生素E 5 mg。選擇三油酸甘油酯(TO)的質(zhì)量X1(mg)、總磷脂和膽固醇的質(zhì)量比X2(w/w)、吐溫80的質(zhì)量X3(mg)作為3因素，每個因素分為3個水平，即設(shè)計(jì)一個3因素3水平的試驗(yàn)表(表1)，根據(jù)Design Expert 8軟件設(shè)計(jì)的因素水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 Box-Benhnken因素水平編碼表

1.4.4 OJP-MVLs的表征

制備濃度為4 mg/mL的麥冬多糖多囊脂質(zhì)體，稀釋5倍，取適量滴至載玻片上，蓋上蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下(400×)觀察多囊脂質(zhì)體形態(tài)。OJP-MVLs經(jīng)適當(dāng)稀釋后用激光粒度分析儀測定粒徑分布。用Zeta電位分析儀測定Zeta電位，操作溫度為25℃，平行測定3次。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按最優(yōu)處方工藝制備理論濃度為4 mg/mL的麥冬多糖多囊脂質(zhì)體，于4℃下放置15天，分別于放樣后的第0天、第5天、第10天和第15天觀察外觀性狀有無變化，同時進(jìn)行包封率和粒徑的測定。

1.5 抗2型糖尿病活性研究

1.5.1 2型糖尿病小鼠模型的建立

在實(shí)驗(yàn)開始前將KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將小鼠置于受控的環(huán)境條件下,室溫(20±2)℃、12 h光照和黑暗周期，并可自由獲取食物和水。用高脂高糖飼料(基礎(chǔ)飼料加20 %的蔗糖，10%的蛋黃粉和10%的豬油)喂養(yǎng)4周，然后禁食12 h后，腹腔注射30 mg/kg的STZ溶液(STZ應(yīng)溶解在pH值為4.2～4.5的0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液中，且在冰浴中配制和保存，現(xiàn)配現(xiàn)用以保障其效果)，觀測血糖2天，再次禁食12 h后腹腔注射STZ 30 mg/kg，給建模藥2周后測定小鼠的空腹血糖，空腹血糖水平≥11.1 mmol/L為造模成功，維持高脂高糖飼料喂養(yǎng)1周后開始給藥。

1.5.2 動物分組及給藥

取40只2型糖尿病小鼠，按空腹血糖水平隨機(jī)分成6組，每組10只，另取正常小鼠10只，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)給藥28天。

正常對照組(Normal control group)：正常小鼠口服灌胃0.3 mL的生理鹽水。

模型對照組(Model control group)：2型糖尿病小鼠口服灌胃0.3 mL的生理鹽水。

二甲雙胍組(Metformin group)：2型糖尿病小鼠口服灌胃二甲雙胍150 mg/kg。

麥冬多糖組(OJP group)：2型糖尿病小鼠口服灌胃OJP 200 mg/kg。

麥冬多糖多囊脂質(zhì)體組(OJP-MVLs group)：2型糖尿病小鼠口服灌胃OJP-MVLs 200 mg/kg。

1.5.3 對小鼠空腹血糖水平的影響

將各給藥組小鼠禁食過夜(不禁水)， 分別于給藥前(第0天)、 給藥后第7、14、21、28天用三諾血糖儀測定尾靜脈血糖值。各給藥組與模型對照組小鼠的空腹血糖水平(Fasting blood glucose,FBG)的數(shù)據(jù)經(jīng)過T檢驗(yàn)分析，比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.5.4 對小鼠口服糖耐量的影響

在給藥治療4周后，對小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。簡言之，將小鼠禁食12 h，然后口服灌胃給予葡萄糖(2.0 g/kg)。在給予葡萄糖后0、30、60、120 min測量血糖值。比較各給藥組小鼠在各個時間點(diǎn)的葡萄糖耐量程度，并計(jì)算曲線下葡萄糖耐量面積(Area under Curve,AUC)。各組測得數(shù)據(jù)值與模型組數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

AUC=0.5×(BG0+BG30)/2+0.5×(BG30+BG60)/2+1×(BG60+BG120)/2

1.5.5 血清胰島素的測定及胰島素抵抗指數(shù)的計(jì)算

小鼠禁食12 h之后，眼球取血，離心后取血清，按照胰島素酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的操作方法，測空腹血清胰島素(Fasting serum insulin,FINS)水平，并計(jì)算出胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment-insulin resistance HOMA-IR)，公式如下。對各組的胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)分別與模型組數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖(FBG)×空腹血清胰島素(FINS)/22.5

2 結(jié)果與討論

2.1 OJP-MVLs的制備與表征

2.1.1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)設(shè)計(jì)的Box-Behnken因素水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2反映了三油酸甘油酯(TO)與麥冬多糖(OJP)的質(zhì)量比X1(w/w)、總磷脂和膽固醇的質(zhì)量比X2(w/w)、吐溫80與麥冬多糖(OJP)的質(zhì)量比X3(w/w)對包封率的影響。結(jié)果，包封率的范圍為62.89～82.37%，表中最佳處方的組成為三油酸甘油酯含量10 mg，總磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為1.5∶1，吐溫80的含量為10 mg。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面模型擬合可反映出三個因素與包封率間的關(guān)系，其二階多項(xiàng)式回歸方程如下，其中X2前的系數(shù)最大，表明總磷脂和膽固醇的質(zhì)量比是影響包封率的主要因素。

較高的相關(guān)系數(shù)R2=0.977 8和較低的變異系數(shù)CV=2.42%(<3%),并且表3顯示失擬項(xiàng)(Lack of Fit)不顯著，表明所擬合的模型具有很高的精密度和適用性。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析(95%置信度)

Note: The symbol of*means the term is significant.

三維響應(yīng)面曲面圖可以更直觀地反映出不同因素對包封率的交互作用，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同獨(dú)立因素對麥冬多糖多囊脂質(zhì)體包封率的交互作用

圖1中的圖A、B、C分別描繪的是X1與X2、X1與X3、X2與X3對OJP-MVLs包封率的交互影響。包封率隨著各變量(三油酸甘油酯含量，磷脂與膽固醇質(zhì)量比，吐溫80含量)的增長而增加，到達(dá)最大值后逐漸下降。軟件的處方優(yōu)化的結(jié)果為：三油酸甘油酯9.93 mg、磷脂與膽固醇質(zhì)量比為1.46以及吐溫80 9.79 mg，包封率的預(yù)測結(jié)果為81.15%。

響應(yīng)面法優(yōu)化后的最佳處方組成為麥冬多糖OJP 24 mg，維生素E 5 mg，DOPC 20 mg，DPPG 4 mg，膽固醇16 mg，三油酸甘油酯10 mg，吐溫80 10 mg。按最佳處方制備OJP-MVLs，平行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包封率平均值為(81.24±2.11)%，OJP-MVLs的包封率測定結(jié)果與模型預(yù)測值之間的偏差小于3%，說明所得到擬合模型可較好地反映出三個因素與包封率間的關(guān)系，其預(yù)測結(jié)果有較高的可信度和準(zhǔn)確性。

2.1.2 OJP-MVLs的表征

如圖2所示，在光學(xué)顯微鏡下(400×)觀察到的多囊脂質(zhì)體呈圓形，粒度圓整，大小均一，每個多囊脂質(zhì)體由許多小囊泡堆積而成，多室結(jié)構(gòu)清晰可見。采用激光粒度測定儀測多囊脂質(zhì)體粒徑，粒徑分布如圖3所示，平均粒徑為15.37 μm，粒徑分布范圍較窄，屬正態(tài)分布。用Zeta電位分析儀測定多囊脂質(zhì)體懸液的Zeta電位為(38.38±3.26)mV。結(jié)果表明,制備的OJP-MVLs分布均勻，具有較高的Zeta電位絕對值，穩(wěn)定性良好。

圖2 顯微鏡下OJP-MVLs形態(tài)(400×)

圖3 OJP-MVLs粒徑分布圖

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性評價結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，所制備的多囊脂質(zhì)體是白色的混懸液，沒有絮凝或沉淀產(chǎn)生，隨著儲存時間的延長，但包封率稍有降低，但不具有顯著性，且粒徑變化不大說明制備的麥冬多囊脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好。

表4 4℃下OJP-MVLs穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Mean,n=3)

圖4 OJP與OJP-MVLs對STZ誘導(dǎo)的 2型糖尿病小鼠空腹血糖的影響Note:**P<0.01 as compared with model control

脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差，會發(fā)生聚集、沉淀，易氧化水解成過氧化物，使得藥物泄露。因此，磷脂的選擇對多囊脂質(zhì)體的穩(wěn)定性至關(guān)重要，DOPC和DPPG的相變溫度分別為-22℃和41℃，而普通卵磷脂的相變溫度是-15～7℃，易發(fā)生相分離，使得膜結(jié)構(gòu)被破壞，藥物泄漏。并且DPPG是一種負(fù)電荷的磷脂，可提高磷脂雙層間的靜電斥力從而防止磷脂膜的合并和破壞，增加穩(wěn)定性。含賴氨酸的外水相，使介質(zhì)的pH值為偏堿性，使脂質(zhì)體體系更加穩(wěn)定。此外在制備過程中除了在油相中加入膜穩(wěn)定劑，如維生素E，還加入了輔助乳化劑(如吐溫80)來穩(wěn)定復(fù)乳。

2.2 抗2型糖尿病活性研究

2.2.1 對小鼠空腹血糖水平的影響

在第0天時，STZ注射給藥的小鼠與正常小鼠相比空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)，說明建模成功，模型小鼠具備高血糖的特征。在給藥1周后，除了模型組，各給藥組2型糖尿病小鼠的FBG水平均出現(xiàn)了明顯的降低。給藥2周后，OJP-MVLs組能顯著降低FBG水平(P<0.01)，且與二甲雙胍組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在給藥4周時，OJP-MVLs組與二甲雙胍組可使2型糖尿病小鼠的FBG降到正常血糖水平，而OJP組FBG水平仍高于正常血糖水平，說明麥冬多糖多囊脂質(zhì)體對于降低2型糖尿病小鼠的FBG水平比原料藥有著更好的效果。

圖5 OJP與OJP-MVLs對STZ誘導(dǎo)的2型 糖尿病小鼠糖耐量的影響Note:**P<0.01 as compared with model control

2.2.2 對小鼠口服糖耐量的影響

各給藥組小鼠的OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5和圖5。在給予葡萄糖后，所有小鼠的血糖呈現(xiàn)出上升的趨勢，1 h之后，所有小鼠血糖水平都開始不同程度的下降，OJP-MVLs組與二甲雙胍組血糖水平下降的程度明顯高于OJP組。在給予葡萄糖120 min時，OJP-MVLs組血糖能恢復(fù)至正常血糖水平，且與二甲雙胍組OGTT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其改善OGTT的效果要明顯優(yōu)于麥冬多糖OJP。比較血糖濃度曲線下面積(AUC)，OJP-MVLs組的AUC值是最接近于二甲雙胍作用效果的。通過對各時間點(diǎn)的血糖值和AUC值分析，OJP-MVLs對2型糖尿病小鼠的糖耐量具有更加明顯的改善作用。

表5 OJP和OJP-MVLs對口服糖耐量的作用

Note:**P<0.01 versus Model control

2.2.3 血清胰島素的測定及胰島素抵抗指數(shù)的計(jì)算

如表6所示，模型對照組的空腹血清胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)水平均顯著增高(P<0.01)，說明了STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型具備了高胰島素血癥和胰島素抵抗的特征，證明該造模是成功的。給藥4周后，與模型組相比，OJP和OJP-MVLs組都能顯著的降低2型糖尿病小鼠的FINS(P<0.01)。并且各給藥組小鼠的胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR也顯著的降低(P<0.01)。多囊脂質(zhì)體組的FINS與HOMA-IR要明顯優(yōu)于原料藥OJP組，并且OJP-MVLs組與陽性藥二甲雙胍的效果相當(dāng)，證明麥冬多糖多囊脂質(zhì)體能更好地增加2型糖尿病小鼠對胰島素的敏感性，改善其胰島素抵抗的癥狀。

表6 OJP和OJP-MVLs對2型糖尿病小鼠空腹血清胰島素 水平(FINS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的影響

Note:**P<0.01 versus Model control

3 結(jié)論

本研究以復(fù)乳法制備麥冬多糖多囊脂質(zhì)體，Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化處方，優(yōu)選的處方為麥冬多糖(OJP)24 mg，維生素E 5 mg，DOPC 20 mg，DPPG 4 mg，膽固醇16 mg，三油酸甘油酯10 mg，吐溫80 10 mg,制得的麥冬多糖多囊脂質(zhì)體包封率高(81.24±2.11)%。對麥冬多糖多囊脂質(zhì)體進(jìn)行了體外表征，結(jié)果表明，制備的多囊脂質(zhì)體呈圓形，粒度圓整，大小均一，每個多囊脂質(zhì)體由許多小囊泡堆積而成，多室結(jié)構(gòu)清晰可見。平均粒徑為15.37 μm，粒徑分布范圍較窄，Zeta電位為(38.38±3.26)mV。麥冬多糖多囊脂質(zhì)體的穩(wěn)定性良好，在15天內(nèi)未出現(xiàn)明顯的絮凝或沉淀現(xiàn)象，包封率與粒徑均無明顯變化。

對麥冬多糖及其多囊脂質(zhì)體治療2型糖尿病的效果進(jìn)行研究，麥冬多囊脂質(zhì)體(OJP-MVLs)能顯著降低2型糖尿病小鼠的FBG水平(P<0.01)，改善口服糖耐量(P<0.01)和胰島素抵抗的癥狀(P<0.01)，且效果優(yōu)于麥冬多糖(OJP)。結(jié)果表明,多囊脂質(zhì)體能增強(qiáng)麥冬多糖治療2型糖尿病的效果，為抗2型糖尿病的天然多糖及其制劑的開發(fā)研究提供了新思路與新載體。