董少瑞,李紹波,路會(huì)俠△

(1.大理大學(xué)2013級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，云南大理 671000;2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是育齡婦女常見(jiàn)病，其發(fā)病機(jī)制至今不明，有研究發(fā)現(xiàn)自噬(Autophagy)[1]可能與EMs的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]；而抑癌基因Beclin-1作為自噬過(guò)程重要的正向調(diào)控因子，參與自噬體形成[3-4]。維甲酸(RA)是天然維生素A的代謝產(chǎn)物，有研究顯示RA可能與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的激素調(diào)節(jié)有關(guān)，但RA對(duì)EMs的具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過(guò)檢測(cè)不同劑量RA作用于正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)時(shí)Beclin-1表達(dá)的變化，探討RA治療EMs的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 選取20例EMs患者標(biāo)本，年齡24～45歲，均已婚，月經(jīng)規(guī)則，術(shù)前3個(gè)月未使用激素類(lèi)藥物，均于2016年1-12月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)，術(shù)中剝離卵巢異位囊腫壁待用，病檢證實(shí)為EMs。另選同期20例因不孕癥行診刮術(shù)患者，年齡23～47歲，無(wú)激素治療，術(shù)后取子宮內(nèi)膜待用，病檢證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜。本研究的所有患者均知情并簽字同意，且由醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)。所有標(biāo)本在離體30 min內(nèi)保存于液氮內(nèi)，需要時(shí)分別取出解凍后行正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞或ESC培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。

1.1.2主要試劑 Beclin-1多克隆抗體(美國(guó)Cell Signal公司)，微管結(jié)合蛋白輕鏈 3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ多克隆抗體(美國(guó) Cell Signal 公司)，氯喹(CQ，美國(guó) Selleckchem 公司)，兔抗人Beclin-1抗體(美國(guó) Santa Ctuz 公司)，山羊抗兔二抗(聯(lián)科生物技術(shù)公司)，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國(guó)Jackson公司)，DAPI(美國(guó)Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞或ESC均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞孵箱內(nèi)，培養(yǎng)基為RPMI-1640(美國(guó)HyClone公司)+10% 新生牛血清(蘭州民海公司)，分為空白對(duì)照組(正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞)、CQ組(ESC)、CQ+RA組(ESC)，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光檢測(cè) LC3是自噬標(biāo)志物，最初位于細(xì)胞質(zhì)，自噬形成時(shí)，胞質(zhì)型LC3(LC3-Ⅱ)轉(zhuǎn)變?yōu)榘ば蚅C3(LC3-Ⅱ)。LC3-Ⅱ在自噬體膜內(nèi)外都有結(jié)合，檢測(cè)LC3熒光斑點(diǎn)是觀察細(xì)胞自噬最直觀的方法。兩種內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞采用免疫熒光染色，觀察細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)。分別取正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及ESC，接種在6孔板中，每個(gè)細(xì)胞設(shè)置3復(fù)孔，待48 h細(xì)胞融合時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。PBS洗滌3次，每孔加入固定液200 μL固定15 min。PBS洗滌3次，每孔加入細(xì)胞通透液200 μL(含0.1% Triton X-100的PBS)，室溫放置10 min。PBS洗滌3次，每孔加入封閉液200 μL，室溫濕盒內(nèi)放置2 h。去除封閉液，每孔加入50 μL稀釋的一抗(Anti-LC3-Ⅱ抗體稀釋度 1∶2 000)。4 ℃冰箱濕盒內(nèi)放置過(guò)夜。去除一抗，PBST洗滌3次。每孔加入50 μL熒光標(biāo)記的二抗，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG稀釋度1∶400。37 ℃孵箱內(nèi)孵育30 min(避光操作)。去除二抗，PBST洗滌3次。每孔加入100 μL DAPI(2 μg/mL)，室溫放置10 min。PBST充分洗滌3次。每孔加入200 μL PBS。倒置熒光顯微鏡觀察(避光操作)。

1.2.3RT-PCR 正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和 ESC分別接種于6孔板中，待生長(zhǎng)至大于80%時(shí)，空白對(duì)照組不做任何處理，CQ組加入CQ，CQ+RA組加入CQ和RA，藥物處理6 h后，用Trzol法(美國(guó) Invitrogen 公司)進(jìn)行總RNA提取(每100 g組織中)，1 μg mRNA用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promage公司)合成cDNA。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性94 ℃ 45 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。GAPDH:上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-AGCC AAATTCGTTGTCATAC-3′；LC3-Ⅱ:上游引物5′-GACGGCTTCCTGTACATGGTTT-3′，下游引物5′-TGGAGTCTTACACAGCCATTGC-3′；Beclin-1:上游引物5′-GCTCCATGCTTTGGCCAATAAC-3′，下游引物5′-ATGGTCAAACTTGTTGTCCCAG-3′。

1.2.4Western blot 正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和 ESC分別用不同濃度RA(5、10、20、40、60、80、100 μmol/L)和(或)CQ處理。取30 g細(xì)胞總蛋白經(jīng)10%凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)入PVDF膜，0.1% Tween 20(TBST；50 mmol/L Tris Cl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl)和3% BSA封閉3 h，按稀釋濃度Beclin-1 1∶500加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，按稀釋濃度1∶1 000加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入發(fā)光劑進(jìn)行成像分析，觀察各實(shí)驗(yàn)分組Beclin-1光密度差異。

1.2.5轉(zhuǎn)染Beclin-1 siRNA 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組及RA處理組，每組設(shè)3 復(fù)孔。轉(zhuǎn)染在24 孔板中進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前1 d 接種細(xì)胞，使得轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)30%。轉(zhuǎn)染前1 h 將孔中培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的RPMI-1640。24 孔板轉(zhuǎn)染分別用50 μL RPMI-1640稀釋20 pmol siRNA和1 μL Lipo 2000 Reagent，將100 μL復(fù)合物滴入細(xì)胞中，4 h 后換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)約80%融合時(shí)，熒光顯微鏡下觀察熒光及轉(zhuǎn)染情況。

1.2.6MTT 96孔板中分別培養(yǎng)ESC，待細(xì)胞生長(zhǎng)為70%～90%時(shí)，加入RA(濃度分別為1、2、4、6、8 μmol/L)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)液、 MTT、 DMSO)，對(duì)照孔(培養(yǎng)液、MTT、DMSO)，每個(gè)樣品和對(duì)照均設(shè)3個(gè)平行樣，孵育24 h后，棄上清液，每孔加入90 μL含1%胎牛血清的RPMI-1640和10 μL的5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)4 h棄上清液，每孔再加入110 μL的DMSO，置于37 ℃ 10 min至紫色結(jié)晶完全溶解后，利用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)其吸光度值(A值)，計(jì)算出細(xì)胞存活率。

2 結(jié) 果

2.1正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及ESC中LC3-Ⅱ的表達(dá) 正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)僅個(gè)別細(xì)胞有少量的LC3熒光斑點(diǎn)，細(xì)胞維持低水平自噬。ESC中出現(xiàn)了明顯的LC3熒光斑點(diǎn)(自噬囊泡)，見(jiàn)圖1。

A:正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞;B:ESC

2.2RA對(duì)LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響 CQ組LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組減少，而CQ+RA組較CQ組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CQ+RA組與空白對(duì)照組比較，Beclin-1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LC3-ⅡmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 RA對(duì)ESC中LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響

2.3不同濃度RA對(duì)ESC Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 隨著RA濃度的增加，ESC Beclin-1蛋白表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度RA作用下ESC Beclin-1蛋白表達(dá)變化

A：PCR；B：Western blot

2.4RA對(duì)siRNA Beclin-1的影響 siRNA Beclin-1在確定的轉(zhuǎn)染條件下可有效沉默ESC中Beclin-1 基因的表達(dá)，而RA可解除siRNA對(duì)Beclin-1的沉默作用，見(jiàn)圖4。

2.5RA細(xì)胞毒性 通過(guò)CQ或siRNA Beclin-1抑制自噬，不同濃度RA對(duì)細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

A：CQ抑制；B：siRNA抑制

3 討 論

自噬是細(xì)胞的胞質(zhì)降解并循環(huán)利用產(chǎn)生能量的過(guò)程。作為細(xì)胞“自我消化”的過(guò)程廣泛貫穿于真核細(xì)胞的諸多生命活動(dòng)，并在多種疾病的病理過(guò)程中扮演重要的角色，尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了極為重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，與自噬相關(guān)的核心調(diào)控通路 PI3K/Akt/mTOR在包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的研究中備受關(guān)注[5]。PI3K/Akt 通路激活 mTOR 表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)節(jié) 缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1)表達(dá)誘導(dǎo) VEGF及胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生，誘發(fā)血管形成和血管通透性增加[6-7]。新陳代謝、炎性反應(yīng)、神經(jīng)退行性病變等都會(huì)對(duì)細(xì)胞形成應(yīng)激刺激，mTOR通路被抑制，使自噬能順利被誘導(dǎo)。自噬信號(hào)的激活可抑制腫瘤血管生成[6]。但自噬在EMs中的作用機(jī)制尚不十分清楚。Beclin-1 作為一種單倍體不足的腫瘤抑制基因，Beclin-1/PI3K-Ⅲ復(fù)合物參與了自噬體的形成及自噬的啟動(dòng)[8]，Beclin-1的表達(dá)亦被用于檢測(cè)自噬的活性。Beclin-1下調(diào)或缺失可促使腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)效應(yīng)，而上調(diào)其表達(dá)將成為某些特定腫瘤的有效治療手段[9]。Beclin-1在卵巢癌中的過(guò)表達(dá)可有效抑制 SKOV3/DDP 細(xì)胞的體外增殖能力及侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。不同臨床分期的EMs中Beclin-1表達(dá)不同，分期越高其表達(dá)越低[11-12]。REN等[13]報(bào)道Beclin-1在異位內(nèi)膜中的表達(dá)遠(yuǎn)低于在位內(nèi)膜；HAMACHER-BRADY等[14]也發(fā)現(xiàn)EMs患者Beclin-1 mRNA 及蛋白表達(dá)低于健康女性。筆者在實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)EMs患者Beclin-1 mRNA表達(dá)較健康人群減少，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

RA有著廣泛的生物學(xué)作用，如參與調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞的激活，促進(jìn)發(fā)育組織上皮細(xì)胞的增殖、分化等[15]。RA在人體細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化受到嚴(yán)格的代謝通路調(diào)控，應(yīng)用于治療某些細(xì)胞增殖性疾病(如白血病)和高VEGF表達(dá)的惡性腫瘤疾病。TEE等[16]發(fā)現(xiàn)RA對(duì)VEGF含量豐富的人早幼粒細(xì)胞(HL-60)內(nèi)膜細(xì)胞效果明顯，主要通過(guò)Tie2信號(hào)途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。廖偉超等[17]報(bào)道依維莫司聯(lián)合RA能誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞分化，且能阻滯細(xì)胞周期而不致細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與依維莫司聯(lián)合RA抑制mTOR信號(hào)通路激活自噬作用有關(guān)。宋兆俠等[18]發(fā)現(xiàn)RA 可降低異位內(nèi)膜組織中 VEGF mRNA和蛋白表達(dá)從而減少病灶內(nèi)血管分布，減小內(nèi)異癥病灶體積。本研究發(fā)現(xiàn)，RA與ESC一起孵育，可以刺激細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)，隨著RA濃度增加，Beclin-1的表達(dá)亦相應(yīng)升高。利用自噬抑制劑CQ或轉(zhuǎn)染siRNA Beclin-1抑制EMs細(xì)胞的自噬后，發(fā)現(xiàn)RA可對(duì)抗自噬抑制劑CQ或基因沉默對(duì)Beclin-1的抑制作用。這些結(jié)果說(shuō)明RA可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，通過(guò)刺激ESC中Beclin-1的表達(dá)，而達(dá)到控制EMs病情進(jìn)展的可能。

雖然近年國(guó)外已有研究表明PI3K/Akt/mTOR通路與EMs關(guān)系密切，但自噬在EMs異位灶形成過(guò)程中的作用是否與該通路有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)少見(jiàn)報(bào)道。RA可能通過(guò)激活自噬、抑制異位病灶中血管的生長(zhǎng)而達(dá)到治療，其中機(jī)制有待進(jìn)一步探索，有可能成為EMs的一種新的治療手段。