馬 晶，康美玲，田忠景，張營霞，丁誠實*，張立華*

石榴為石榴科石榴屬植物，含有多酚、黃酮、生物堿、甾體類以及三萜類化合物等次生代謝物，其中多酚類含量最高[1-3]。鞣花酸是石榴中的一種多酚類物質(zhì)，是沒食子酸的二聚衍生物，呈反式?jīng)]食子酸單寧結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等多種生物活性[4-7]。最新研究表明，鞣花酸還可以抑制3T3-L1脂肪細胞內(nèi)脂肪酸合成酶活性，減少脂肪生成，預(yù)防和治療肥胖[8-9]。鞣花酸作為多酚類物質(zhì)，溶解性差、不穩(wěn)定、受熱易氧化、不易吸收，難以穩(wěn)定、長期地發(fā)揮作用[10]。若能夠制備成鞣花酸微球則可能解決以上問題。

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取的一種多糖類碳水化合物，是一種帶負電荷的多糖類高分子材料；由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸經(jīng)糖苷鍵連接，從而形成的一類線性鏈狀陰離子聚合物[11-12]。以海藻酸鈉/殼聚糖作為藥物載體是近年來在藥物研究方面出現(xiàn)的一種應(yīng)用于給藥研究的新技術(shù)，海藻酸鈉具有較低的細胞毒性、可被生物降解、良好的生物相容性和成膜性等特點，被廣泛應(yīng)用于藥物載體的制備，特別是對控釋和緩釋制劑的研究[13-15]。海藻酸鈉微球綜合了生物可降解高分子材料海藻酸鈉的多糖性、微尺度材料的抗菌和多微孔等特性，其在生物醫(yī)藥、工業(yè)及食品等方面的應(yīng)用研究已經(jīng)越來越多地受到人們的關(guān)注[16-18]。

本研究采用海藻酸鈉和殼聚糖包裹石榴皮鞣花酸，制備鞣花酸微球，以掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜儀和釋放率檢測儀鑒定制備的鞣花酸微球。用不同質(zhì)量濃度的鞣花酸微球體外培養(yǎng)前脂肪細胞，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞在不同時間的生長情況，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察細胞形態(tài)、數(shù)目的變化；對誘導(dǎo)成功出現(xiàn)脂滴的細胞進行油紅O染色，觀察細胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小，并采用異丙醇萃取法定量檢測脂肪生成量。本研究為石榴皮鞣花酸在食品保健方面的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴皮鞣花酸由實驗室自制并純化（純度＞98%）[2]；鼠源性前脂肪細胞系3T3-F442A 美國模式培養(yǎng)物集存庫；鞣花酸標準品（純度＞98%） 上海源葉生物科技有限公司；DMEM F12高糖培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶 美國Gibco公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、地塞米松、吲哚鎂鋅 美國Sigma公司；油紅O（蘇丹紅） 上海生工公司；HE染色試劑盒 北京Solarbio公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TM-1000臺式SEM 日本Hitachi公司；FTIR-7600傅里葉變換紅外光譜儀 澳大利亞Lambda公司；DF-4壓片機 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；UV-2000紫外分光光度計 上海尤尼柯公司；Multiskan智能酶標儀、371型CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；臺式真空冷凍干燥機 上海京孚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鞣花酸微球的制備

移取20 mL 0.1 mol/L鹽酸羥胺溶液注入一干燥潔凈的250 mL燒杯中，加入80 mL 0.5 g/L海藻酸鈉溶液后搖勻，加入0.2 g鞣花酸粉末，快速搖勻后置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱1 h，經(jīng)微孔濾膜過濾得到濾液。向濾液中加入5 g殼聚糖作為緩釋劑，用磁力攪拌器攪拌1 h后形成均一穩(wěn)定的懸濁液，再加入5 mL體積分數(shù)2%戊二醛溶液，－80 ℃下冷凍2 h后，－50 ℃下真空干燥12 h，獲得海綿狀復(fù)合物，經(jīng)研磨粉碎得到最終產(chǎn)物[19-20]。

1.3.2 鞣花酸微球的鑒定

1.3.2.1 SEM觀察

打開SEM，排氣泵工作至Air燈為Ready狀態(tài)。樣品臺上貼上導(dǎo)電雙面膠，將少量鞣花酸、海藻酸鈉、殼聚糖、鞣花酸微球依次平鋪在雙面膠上，然后放入SEM暗箱中，關(guān)閉艙門，排氣至Air燈為Ready狀態(tài)。加速電壓15.0 kV，掃描范圍6.5 mm，掃描速率為慢3。拍照并保存圖片。

1.3.2.2 傅里葉變換紅外光譜掃描

充分研磨一定量的溴化鉀及鞣花酸、海藻酸鈉、殼聚糖、鞣花酸微球。將研磨好的待測樣品和溴化鉀以1∶100的質(zhì)量比混勻并進行壓片，依次放入傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描，保存圖譜并分析。波數(shù)范圍4 000～400 cm－1，波數(shù)精度1 cm－1。

1.3.2.3 鞣花酸微球中鞣花酸的包封率及釋放率的測定

稱取鞣花酸微球200 mg，研磨粉碎，用5 mL無水乙醇溶解，超聲處理2 h，置于37 ℃恒溫振蕩儀中振蕩，棄去沉淀后用體積分數(shù)50%乙醇溶液稀釋，利用紫外分光光度法在254 nm波長處測定其吸光度A，以標準曲線法計算溶液中游離鞣花酸質(zhì)量，包封率按式（1）計算[21]。

式中：200為鞣花酸微球質(zhì)量（mg）。

稱取20 mg的鞣花酸微球，置于500 mL錐形瓶中，加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.4）200 mL，室溫孵育，分別在3、6、12、24、36 h時吸取樣品，于254 nm波長處測定吸光度A，以標準曲線法計算溶液中游離鞣花酸含量，按式（2）計算累計釋放率。

式中：20為鞣花酸微球質(zhì)量（mg）。

1.3.3 鞣花酸微球?qū)η爸炯毎L影響的測定

當3T3-F442A前脂肪細胞生長到鋪滿培養(yǎng)瓶80%時，用胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，接種100 μL于96 孔板各孔中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入0.1、0.3、0.5 g/L的鞣花酸微球懸液，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3 個重復(fù)，并設(shè)置對照組（未添加鞣花酸微球）。將藥物處理后的前脂肪細胞分別培養(yǎng)6、12、24、36 h后，向各孔中加入0.5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL二甲基亞砜。選擇570 nm波長使用酶標儀檢測各孔的OD值，記錄結(jié)果[22-23]，OD值與細胞存活率呈正相關(guān)。藥物作用細胞6 h后進行HE染色，觀察細胞形態(tài)。

1.3.4 鞣花酸微球?qū)η爸炯毎芍只绊懙臏y定

待脂肪細胞在12 孔板內(nèi)長滿、接觸抑制2 d后，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含質(zhì)量分數(shù)5%胎牛血清，17 nmol/L胰島素、250 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、60 μmol/L吲哚美辛和100 nmol/L 地塞米松），誘導(dǎo)培養(yǎng)22 d[24-25]。在成脂誘導(dǎo)的同時藥物組分別加入0.1、0.3 g/L和0.5 g/L的鞣花酸微球，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3 個重復(fù)，并設(shè)置對照組（未添加鞣花酸微球）。

棄去細胞培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液沖洗細胞3 次。4%（體積分數(shù)，下同）甲醛溶液固定細胞30 min，超純水沖洗細胞3 次。0.3%油紅O染色液染色15 min，60%乙醇溶液分化數(shù)秒。超純水清洗，倒置顯微鏡下觀察細胞，拍照記錄。用異丙醇對染色的細胞萃取油紅O，測定590 nm波長處吸光度A[26-27]，按式（3）計算脂肪形成的抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進行成組數(shù)據(jù)T檢驗，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鞣花酸微球的鑒定

2.1.1 SEM觀察結(jié)果

圖1 海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸復(fù)合物SEM圖Fig. 1 SEM images of sodium alginate-chitosan-ellagic acid complex

石榴皮鞣花酸呈針狀晶體結(jié)構(gòu)（圖1A中箭頭所示），形狀規(guī)則，長度為（3.20±0.78）μm；海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸復(fù)合物（圖1B）呈多面球形結(jié)構(gòu)，直徑為（13.82±3.29）μm，且看不到鞣花酸的針狀結(jié)構(gòu)，推測鞣花酸已經(jīng)與海藻酸鈉/殼聚糖形成復(fù)合物。

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖2 海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸復(fù)合物傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of sodium alginate-chitosanellagic acid complex

如圖2所示，海藻酸鈉傅里葉變換紅外光譜曲線中：3 496～3 548 cm－1處的寬峰是O—H鍵的伸縮振動峰；2 946 cm－1處是C—H鍵的伸縮振動峰；1 646 cm－1處是吡喃環(huán)化合物C—O—C的伸縮振動峰；1 076 cm－1處是環(huán)醇結(jié)構(gòu)上的—OH的振動峰；1 427 cm－1附近的吸收峰是羧酸根離子的對稱伸縮振動峰。殼聚糖紅外曲線中：2 940 cm－1處是C—H的伸縮振動吸收峰；1 687 cm－1處是酰胺I鍵（C＝O）的特征吸收峰；1 614 cm－1處是酰胺II鍵（N—H面內(nèi)彎曲）的特征吸收峰；—CH2彎曲和—CH3變形振動吸收峰在1 430 cm－1處顯示；—CH3對稱變形振動和—CH彎曲振動吸收峰在1 336 cm－1處顯示；酰胺III鍵譜帶和—CH2搖擺吸收峰在1 278 cm－1處顯示；C—O伸縮振動吸收峰則在1 076、1 029 cm－1處顯示。鞣花酸紅外曲線中：1 525、1 458 cm－1處是苯環(huán)骨架的伸縮振動吸收峰；3 374 cm－1處是O—H伸縮振動吸收峰；1 726、1 625 cm－1處是羧基的吸收峰。海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸復(fù)合物在3 444 cm－1處有和海藻酸鈉相同的O—H吸收峰，在1 434 cm－1處有和海藻酸鈉相同的羧基吸收峰，在1 334 cm－1處有和殼聚糖相同的—CH彎曲和—CH3變形振動吸收峰，在1 620 cm－1處有和鞣花酸相同的羧基伸縮振動峰，在1 518 cm－1處有和鞣花酸相同的苯環(huán)結(jié)構(gòu)特征伸縮振動吸收峰。多種相同之處說明海藻酸鈉、殼聚糖、鞣花酸形成了復(fù)合物。

2.1.3 鞣花酸微球中鞣花酸釋放率的分析

鞣花酸微球中的鞣花酸的包封率為28.9%。鞣花酸在不同時間從微球中釋放出來，0～6 h為緩慢釋放階段，僅釋放9%的鞣花酸；6～24 h為快速釋放階段，釋放率達到63%；24～36 h再次進入緩慢釋放階段，釋放21%的鞣花酸（圖3）。鞣花酸微球中鞣花酸能夠緩慢釋放，也說明海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸微球制備成功。

圖3 海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸微球中鞣花酸的釋放率Fig. 3 Release rates of ellagic acid from sodium alginate-chitosanellagic acid microspheres

2.2 鞣花酸微球?qū)η爸炯毎L的影響

2.2.1 MTT法檢測鞣花酸微球?qū)η爸炯毎L的影響

表1 鞣花酸微球?qū)η爸炯毎婊盥实挠绊慣able 1 Effect of ellagic acid microspheres on preadipocyte survival rate

如表1所示，與對照組相比，0.1 g/L鞣花酸微球處理前脂肪細胞12 h后，細胞存活率顯著降低，24 h后細胞存活率極顯著降低；0.3 g/L和0.5 g/L鞣花酸微球處理細胞6 h后，細胞存活率顯著降低，12 h后細胞存活率極顯著降低。推測鞣花酸微球質(zhì)量濃度越大、處理細胞時間越長，對前脂肪細胞存活率的抑制就越大。

2.2.2 HE染色觀察鞣花酸微球?qū)η爸炯毎L的影響

圖4 HE染色觀察不同質(zhì)量濃度鞣花酸微球?qū)η爸炯毎婊畹挠绊懀?00×）Fig. 4 HE staining for evaluating the effect of different concentrations of ellagic acid microspheres on the survival of preadipocytes (400 ×)

由圖4A可知，正常前脂肪細胞形態(tài)較好、較大，數(shù)目較多；細胞核染色紫色明顯；細胞質(zhì)充盈，顏色為紅色（圖中未顯示）。加入鞣花酸微球后細胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的固縮，細胞數(shù)量減少；隨著加入鞣花酸微球質(zhì)量濃度的增大，細胞固縮的程度增加，細胞數(shù)量明顯減少，說明鞣花酸微球?qū)η爸炯毎纳L有一定的抑制作用（圖4B～D）。

2.3 鞣花酸微球?qū)η爸炯毎芍只挠绊?/h3>

2.3.1 油紅O染色成脂分化的3T3-F442A細胞觀察

前脂肪細胞在成脂誘導(dǎo)22 d后進行油紅O染色，幾乎所有細胞內(nèi)都有較大脂滴，脂滴指環(huán)結(jié)構(gòu)明顯。加入鞣花酸微球后細胞脂滴變小，脂滴數(shù)量減少；隨著加入鞣花酸微球質(zhì)量濃度的增大，細胞脂滴減小的程度增大，脂滴數(shù)量顯著減少，說明鞣花酸微球?qū)η爸炯毎某芍休^強的抑制作用，且具有量效關(guān)系（圖5）。

圖5 不同質(zhì)量濃度鞣花酸微球?qū)η爸炯毎芍只挠绊懀?00×）Fig. 5 Effects of different concentrations of ellagic acid microspheres on adipogenic differentiation of preadipocytes (400 ×)

2.3.2 鞣花酸微球?qū)η爸炯毎芍只囊种?/p>

圖6 不同質(zhì)量濃度鞣花酸微球?qū)Ξ惐驾腿〖毎麅?nèi)油紅O的影響Fig. 6 Effect of ellagic acid microspheres on adipogenic differentiation of preadipocytes as evaluated by isopropyl alcohol extraction of intracellular oil red O

如圖6所示，0.1 g/L鞣花酸微球能夠顯著降低前脂肪細胞內(nèi)的脂滴形成，抑制率為42.5%；0.3 g/L和0.5 g/L鞣花酸微球能夠極顯著降低前脂肪細胞的成脂分化，抑制率分別為65.0%和80.0%。

3 結(jié) 論

石榴皮鞣花酸、海藻酸鈉和殼聚糖都是功能性食品的天然活性成分，本研究以海藻酸鈉和殼聚糖作為包裹材料，有效地包裹石榴皮鞣花酸，制備成鞣花酸復(fù)合微球。通過SEM和傅里葉變換紅外光譜鑒定，顯示鞣花酸微球制備成功，且微球中的鞣花酸能夠緩慢釋放。鞣花酸微球增強了鞣花酸的穩(wěn)定性，還使被包裹的鞣花酸具有抗熱、耐光、容易貯存和運輸?shù)雀嘀毓δ芎土己玫奶匦訹17-18]。SEM觀察結(jié)果顯示制備出的海藻酸鈉-殼聚糖-鞣花酸復(fù)合物顆粒偏大，平均直徑為13.82 μm，沒有達到更微觀的尺寸?？赡艿脑蚴鞘衿坊ㄋ峋w結(jié)構(gòu)尺寸已達到微米級，制備的包合物只能更大。但與張華等[28]的結(jié)果相比，微球尺寸已經(jīng)縮小近100 倍。

細胞實驗中，鞣花酸微球能抑制前脂肪細胞的生長以及成脂分化。鞣花酸質(zhì)量濃度越大、處理時間越長，細胞的存活率越低，呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。在低質(zhì)量濃度條件下，在鞣花酸緩慢釋放階段，鞣花酸微球?qū)毎婊盥实挠绊戄^小；而在的鞣花酸快速釋放階段，鞣花酸微球?qū)毎婊盥实挠绊戄^大，故鞣花酸微球的活性是與鞣花酸釋放情況相關(guān)的。在中、高質(zhì)量濃度條件下，即使處于緩慢釋放階段，但由于微球質(zhì)量濃度較高，釋放的鞣花酸總量較大，也能夠顯著抑制前脂肪細胞的成活率及成脂分化。

鞣花酸作為石榴皮中的有效成分，提取得率可達15.56%[29]。把石榴皮鞣花酸做成海藻酸鈉/殼聚糖微球，可以控制鞣花酸緩慢釋放，保證微球具有更好的生物相容性，進入細胞的可能性更大，而且滲入的速度緩慢，使加入的鞣花酸更長久、有效地作用于細胞。把鞣花酸做成微球后還具有靶向作用，使鞣花酸作用目標更加準確[30]。隨著石榴皮鞣花酸微球的研制及其在食品保健方面應(yīng)用的深入研究，石榴的綜合利用將得到進一步的發(fā)展。