程金章，楊景樸，仲 煒，王海濤,趙 胤，陳俊俊，王宗貴*，牙韓盛

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.岳陽(yáng)縣人民醫(yī)院)

近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞理論的提出給腫瘤治療帶來(lái)了曙光,該理論認(rèn)為:腫瘤組織中極少數(shù)的腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、 耐受和轉(zhuǎn)移的根源[1,2]。 CD133被普遍認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞表面特異性表達(dá)蛋白,可以作為多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[3-6]。目前在喉癌中CD133被認(rèn)為是人喉癌Hep-2細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[7]。我們前期研究也證實(shí)CD133+喉癌腫瘤干細(xì)胞具有化療抵抗性[8]。因此以腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療為腫瘤患者帶來(lái)了希望。

免疫重組毒素是利用基因工程技術(shù)將天然毒素的受體結(jié)合區(qū)基因替換成可與腫瘤細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的抗體或細(xì)胞因子基因,制備出具有特異性靶向作用的毒素分子，是腫瘤導(dǎo)向治療研究中的熱點(diǎn)之一,白喉毒素(DT)由535個(gè)氨基酸殘基組成的相對(duì)分子質(zhì)量為58000 的多肽,由受體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和酶活性區(qū)3 個(gè)在空間上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成[9]，適于進(jìn)行各種基因工程操作。本研究采用基因工程技術(shù)將CD133(scFV)與白喉毒素片段(DAB389)進(jìn)行融合,通過(guò)誘導(dǎo)、表達(dá)、純化,獲得了靶向殺傷CD133陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞的免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV),為靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒及主要試劑

T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker、表達(dá)載體pET28 a(+)， BL21(DE3)，CHO(CD133+)工程細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞由吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。pUC57-DAB389由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成； NcoI (8 U/μl)、BamHI (8 U/μl)、 MunI (8 U/μl)，XhoI(8 U/μl)、T4 DNA Ligase (350 U/μl)、克隆載體pMD18T購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自Biomega公司。

1.2引物

DNA序列見(jiàn)表1。

表1 引物DNA序列

1.3目的基因構(gòu)建與鑒定

按照T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker基因序列分別設(shè)計(jì)2條特異性引物序列(P1、P2)(見(jiàn)表1)分別對(duì)T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶切后以T-CD133 VH 、T-CD133(scFV) VL-linker為模板，以P1下、P2上為引物擴(kuò)增CD133(scFV) ，CD133(scFV)片段經(jīng)凝膠純化后進(jìn)行TA克隆得到質(zhì)粒 pMD18T-CD133(scFV)。 用引物P3(見(jiàn)表1)對(duì)pMD18T-CD133(scFV)進(jìn)行擴(kuò)增。pUC57-DAB389和pET28a(+)通過(guò)NcoI/BamHI雙酶切構(gòu)建pET28 a(+)-DAB389。

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將CD133(scFV)片段定向連接至中間載體pET28-DAB389上，構(gòu)建pET28-DAB389- CD133(scFV)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)BL21(DE3)中，構(gòu)建重組菌株，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，核苷酸測(cè)序。

1.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分析

將含有pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)重組質(zhì)粒的菌株1∶1 000接種于4 ml濃度為50 μg/ml 卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。次日將上述菌液1∶100轉(zhuǎn)接于20 ml含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600=1，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，37 ℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。離心收集菌體。分別取誘導(dǎo)前后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.6重組蛋白的純化及鑒定

將重組蛋白超聲裂解后,根據(jù)Ni 柱的使用說(shuō)明純化,采用透析法對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，同時(shí)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot 鑒定，純品蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后,用電轉(zhuǎn)移方法將電泳膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,進(jìn)行Western blot 印跡分析。一抗為mouse-anti-His(1∶5 000)。二抗為FITC-羊抗小鼠IgG(1∶2 000)。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性

首先用CD133單克隆抗體檢測(cè)CHO(CD133+)工程細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞的CD133表達(dá)率。然后用CHO(CD133+)工程細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞檢測(cè)DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性。陰性對(duì)照組分別為單獨(dú)CHO(CD133+)細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞，細(xì)胞加二抗對(duì)照組，細(xì)胞加一抗、二抗對(duì)照組。一抗為mouse-anti-His(1∶5 000)。二抗為FITC-羊抗小鼠IgG(1∶2 000)。收集細(xì)胞，每管5×105個(gè)，用PBS洗滌；加入免疫毒素DAB389-linker-CD133(scFV)，用PBS稀釋至終濃度范圍為10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml，測(cè)定CD133表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1DAB389-Linker-CD133(scFV)原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)通過(guò)NcoI/ BamHI雙酶切后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切鑒定，酶切片段大小為1 891 bp,與預(yù)期相符，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，核苷酸序列分析正確，與理論值一致。

2.2目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳分析

通過(guò)對(duì)菌種 BL21(DE3)/pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)進(jìn)行小量誘導(dǎo)后， SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，構(gòu)建的重組菌株能高效地表達(dá)重組蛋白，相對(duì)分子量大小約66 KDa。而空菌對(duì)照組和未誘導(dǎo)組均未見(jiàn)相應(yīng)表達(dá)帶,表明該重組菌表達(dá)了DAB389-Linker-CD133(scFV)融合蛋白。見(jiàn)圖2。

2.3DAB389-Linker-CD133(scFV)蛋白純化及westernblot鑒定

通過(guò)對(duì)粗蛋白DAB389-Linker-CD133(scFV) 進(jìn)行Ni柱的純化制備，得到精蛋白， SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白分子量大小約為66 kDa， AlphaImager 1220 v5.5軟件分析純度為95%。通過(guò)Ni-NTA親和純化、透析復(fù)性、超濾濃縮的蛋白終產(chǎn)品 DAB389-Linker-CD133(scFV) 進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot實(shí)驗(yàn)，證明所表達(dá)制備的蛋白與設(shè)計(jì)的一致。見(jiàn)圖3。

1 空菌;2 誘導(dǎo)后上清;3誘導(dǎo)前沉淀；4 誘導(dǎo)后沉淀檢驗(yàn) 注：1.SDS-PAGE電泳；A Western blot

圖1DAB389-Linker-CD133(scFV)表達(dá)圖2SDS-PAGE電泳結(jié)果圖3載體的酶切鑒定純化重組蛋白復(fù)性后SDS-PAGE電泳及Westernblot檢驗(yàn)

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性

用CD133單克隆抗體檢測(cè)CHO(CD133+)工程細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞的CD133表達(dá)率，CHO工程細(xì)胞CD133表達(dá)率為86.78%，CHO-S細(xì)胞的CD133表達(dá)率為13.94%。DAB389-Linker-CD133(scFV)濃度為20 μg/ml時(shí)與CHO工程細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞的結(jié)合率分別為41.3%，和7.87%。實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組蛋白DAB389-Linker-CD133(scFV) 對(duì)CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有較強(qiáng)靶向性。見(jiàn)圖4。

3 討論

目前越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，存在著極少量的腫瘤干細(xì)胞，與腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)放化療抵抗關(guān)系密切。傳統(tǒng)治療方法雖使腫瘤細(xì)胞總數(shù)量減少，腫瘤體積縮小或臨床診斷消失，但殘留下的腫瘤干細(xì)胞可以逃逸抗腫瘤藥物，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組蛋白與CHO(CD133+)、CHO-S細(xì)胞結(jié)合活性

CD133是位于細(xì)胞膜表面具有5個(gè)跨膜區(qū)的糖蛋白，分子量為117 kD。CD133最初在造血干或祖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮前體細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞中經(jīng)常有表達(dá)，而在成熟的血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞則沒(méi)有表達(dá)。CD133表達(dá)的重要特征是隨著細(xì)胞的分化而迅速下降，這也使CD133成為分離干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記[10]。CD133在腦腫瘤、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、喉癌等多種實(shí)體瘤干細(xì)胞研究中發(fā)揮了重要作用[3-8,11]。因此本研究瞄準(zhǔn)腫瘤干細(xì)胞，以CD133為靶點(diǎn)，利用scFV 將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)柔性軟肽連接，具有良好的靶向性，降低了免疫原性。構(gòu)建具有靶向CD133的優(yōu)良遞送藥物載體，與免疫毒素融合構(gòu)成具有多重功能的融合蛋白，以達(dá)到與腫瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合殺傷的目的[12]。研究中最常應(yīng)用的免疫毒素有白喉毒素、假單胞桿菌外毒素、蓖麻毒素等[13,14]。 DAB389作為白喉毒素的酶活性區(qū),它通過(guò)阻止延長(zhǎng)因子-2 在核糖體內(nèi)促進(jìn)多肽鏈延長(zhǎng)而抑制蛋白質(zhì)合成造成細(xì)胞死亡,具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性,是靶向毒素常用的毒素分子。

本研究用基因工程原理和方法，將CD133/(scFV)和DAB389通過(guò)Linker進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV) 的重組表達(dá)質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，蛋白電泳證實(shí)有與預(yù)期分子量大小相符的蛋白產(chǎn)生，經(jīng)鑒定為目的蛋白，經(jīng)過(guò)親和層析獲得純化的免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV)，透析復(fù)性后獲得具有活性的DAB389-Linker-CD133(scFV)。通過(guò)對(duì)CHO(CD133+)和CHO-S細(xì)胞的靶向性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)DAB389-Linker-CD133(scFV)對(duì)表達(dá)CD133抗原具有良好的靶向性。

DAB389-Linker-CD133(scFV)有望對(duì)CD133+腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向殺傷，以提高放化療的敏感性。為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的靶向殺傷藥物奠定了理論基礎(chǔ)。