包 洪，張曉剛，金玉芬，常 靜，吳麗霞，于 庭*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130041； 2.北京英諾特生物技術(shù)有限公司；3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院)

呼吸道傳染病是高發(fā)流行病，具有人群普遍易感，誘發(fā)原因廣泛，傳染性強(qiáng)，傳播速度迅速，較難控制等特點(diǎn)[1]，如今呼吸道感染已占兒科門診的60%以上。而快速高效地診斷出患者感染的呼吸道病原體類型有助于盡快確定治療方案，防止病情加重和遷延不愈。血清學(xué)檢測是臨床常用的呼吸道傳染病初步篩查、診斷方法。間接免疫熒光法是臨床檢測的經(jīng)典及金標(biāo)準(zhǔn)實驗[2]，因其方便、靈敏、特異、高效的特點(diǎn)常用于臨床病原體的初步診斷。為此我們與北京英諾特生物技術(shù)有限公司合作，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，制備用于檢測肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)、甲型/乙型流感病毒(FluA/B)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、嗜肺軍團(tuán)菌(LP)血清1型共8種常見呼吸道病原體抗原片，并制備成試劑盒，現(xiàn)對此試劑盒進(jìn)行性能評價。

1 材料與方法

1.1一般資料吉林大學(xué)第二醫(yī)院2016年6月-2017年10月收治的呼吸道疾病感染患者。MP確診患者240例，排除患者285例；CP確診患者207例，排除患者313例；Flu A確診患者262例，排除患者154例；Flu B確診患者203例，排除患者282例；PIV確診患者207例，排除患者260例；RSV確診患者202例，排除患者359例；ADV確診患者205例，排除患者258例；LP1確診患者28例，排除患者288例。

1.2菌種來源肺炎支原體FH株，肺炎衣原體TW-183株；甲型流感病毒A/Taiwan/8949/2008(H1N1)株；乙型流感病毒B/Beijing/1/1987株；副流感病毒1、2、3型分別為HPIV1/USA/32193A/2010，HPIV-06-25，HPIV-06-4株；呼吸道合胞病毒Long株；腺病毒3型和嗜肺軍團(tuán)菌1型L10/23株均由北華大學(xué)提供。

1.3試劑與儀器日本奧林巴斯熒光顯微鏡。西班牙VIRCELL,S.L公司生產(chǎn)的九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒(間接免疫熒光法)，北京英諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的呼吸道感染病原體抗體IgM檢測試劑盒(間接免疫熒光法)。

1.4病原體抗原片的制備

1.4.1Mp、Cp、RSV、ADV、Flu A/B、PIV病原體抗原片的制備

a) 將各項病原體用含有2%胎牛血清的DMEM(細(xì)胞維持液)稀釋成10-3倍。

b) 將Mp、Cp、RSV菌株分別接種在生長良好的Hep-2單層細(xì)胞培養(yǎng)物，ADV接種于A5492單層細(xì)胞培養(yǎng)物，F(xiàn)luA/B接種于MDCK單層細(xì)胞培養(yǎng)物，PIV接種于LLC-MK2單層細(xì)胞培養(yǎng)物中。37℃環(huán)境下CO2培養(yǎng)箱吸附1小時，加細(xì)胞維持液20 ml，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)[3]。

c) 待多于25%左右的細(xì)胞出現(xiàn)病態(tài)表現(xiàn)后收獲，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并滴加在蓋玻片上[4]。37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，0.01M PBS浸洗一次，然后在生物安全柜中晾干。

d) 培養(yǎng)至細(xì)胞伸展爬片后清洗、-20℃無水乙醇固定過夜。取出后風(fēng)干為制備好的各病原體抗原片。

1.4.2LP1病原體抗原片的制備

a)將LP1接種于BCYE營養(yǎng)平板上，在-37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)72 h，待長出單菌落。

b)挑取單菌落，用1 mg/mL BSA的無菌水作為菌體稀釋液，重懸菌體OD值至0.6。

c)以20 μl的涂布量涂布蓋玻片。

d)把玻片放入丙酮液內(nèi)，-20℃固定過夜。取出后風(fēng)干為制備好的嗜肺軍團(tuán)菌抗原片。

1.5質(zhì)量控制

利用各病原體的質(zhì)控血清對抗原片進(jìn)行活性檢測。標(biāo)準(zhǔn)如下：每種病原體的3份陰性質(zhì)控血清均不出現(xiàn)特異性綠色熒光，反應(yīng)孔上細(xì)胞呈紅色。最低檢出限質(zhì)控血清應(yīng)檢測到部分細(xì)胞呈較弱的綠色熒光；中等陽性質(zhì)控血清應(yīng)檢測出部分的細(xì)胞呈中等強(qiáng)度綠色熒光；檢測強(qiáng)陽性質(zhì)控血清，應(yīng)有感染細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。

1.6試劑盒的制備

確定FITC的滴定濃度以制備FITC結(jié)合物。在每個項目陽性血清確定稀釋倍數(shù)后，混勻配置后再次檢測，確認(rèn)混合配置陽性對照品合格后確定為試劑盒的陽性對照血清。用10%的新生牛血清將正常人血清進(jìn)行10倍稀釋為本試劑盒的陰性血清。用自制參考品檢定中間品和半成品檢定后可組裝成成品盒，經(jīng)過質(zhì)檢完成試劑盒的制作。

1.7臨床病例血清的檢測方法

按照以下方法運(yùn)用新研發(fā)試劑盒對血清進(jìn)行檢測。

a)在發(fā)病初期采集患者靜脈血2.0 ml-3.0 ml，分離血清，PBS等量稀釋。

b)將30 μl稀釋后的血清加入150 μl吸附劑中，徹底混勻后移至離心管，離心分離去除沉淀[5]。

c)每個檢測孔加樣15 μl吸附劑處理過的血清。在一個載玻片的每孔中加入15 μl不稀釋的陽性對照，在另一載玻片的每孔中加入15 μl不稀釋的陰性對照，使其在37℃濕潤環(huán)境下反應(yīng)60 min。

d)純化水沖洗，PBS洗3次，每次10 min。自然晾干[6]。

e)分別將FITC 15 μl加樣在檢測孔內(nèi)，37℃濕潤環(huán)境下反應(yīng)30 min。

f)純化水沖洗，PBS洗3次。自然晾干。

g)在每孔中加入幾滴封閉介質(zhì)，蓋玻片封片。

h)在熒光顯微鏡400倍視野下觀察。

使用VIRCELL,S.L公司生產(chǎn)的試劑盒對相同血清樣本按照其說明書方法進(jìn)行檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理計數(shù)資料的kappa值和χ2統(tǒng)計學(xué)結(jié)果均來自SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。

2 結(jié)果

2.1判定標(biāo)準(zhǔn)

由于FITC在熒光顯微鏡下呈黃綠色熒光。MP、Flu A/B、PIV、RSV、ADV的IgM在紅色細(xì)胞的胞膜、胞質(zhì)和胞核上可見黃綠色熒光。CP和LP1的IgM在黑色背景下可見典型的桿狀、球桿狀和球狀黃綠色熒光?？瞻讓φ占?xì)胞呈現(xiàn)紅色，無其他顏色熒光。8種病毒IgM在每個視野下陽性細(xì)胞應(yīng)達(dá)到1%-15%可判斷為陽性。使用新研發(fā)試劑盒陽性和陰性結(jié)果圖譜如圖1。

圖1 新研發(fā)試劑盒8種病原體檢測結(jié)果圖譜

注：MP，CP,FluA,FluB,PIV,RSV,ADV,LP分別為8種病原體的陽性檢測結(jié)果；NEG為相應(yīng)病原體的陰性檢測結(jié)果；Control為空白對照。

2.2MP的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對MP-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑盒檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.958。如表1。

2.3CP的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對CP-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑盒檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.960。如表2。

2.4FluA的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對Flu A-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑盒檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.964。如表3。

表1 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對MP的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為0.36，P>0.05。

表2 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對CP的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為2.5，P>0.05。

表3 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對Flu A的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為0.13，P>0.05。

2.5FluB的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對Flu B-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑盒檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.945。如表4。

表4 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對Flu B的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為0.07，P>0.05。

2.6PIV的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對PIV-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑盒檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.944。如表5。

2.7RSV的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對RSV-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.946。如表6。

表5 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對PIV的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為1.23，P>0.05。

表6 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對RSV的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為0.07，P>0.05。

2.8ADV的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對ADV-gM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.969。如表7。

表7 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對ADV的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為0.13，P>0.05。

2.9LP1的檢測結(jié)果

使用新研發(fā)試劑盒對LP1-IgM的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑檢測結(jié)果具有高度一致性，Kappa值為0.961。如表8。

表8 新研發(fā)試劑盒與Vircell檢測試劑盒對LP1的檢測結(jié)果對比

注：χ2值為0.5，P>0.05。

2.10新研發(fā)試劑盒與VIRCELL,S.L公司試劑盒對8種呼吸道感染病原體檢測的符合率

使用新研發(fā)試劑盒對8種病原體的測試結(jié)果與VIRCELL,S.L公司試劑盒檢測結(jié)果具有較高的符合性，陽性符合率、陰性符合率和總符合率均在95%以上。如表9。

表9 新研發(fā)試劑盒與同類檢測試劑盒對9種呼吸道感染病原體的檢測符合率

3 討論

世界衛(wèi)生組織于2014年5月更新了有關(guān)全球疾病狀況的評估報告，報告顯示，在過去10年中，缺血性心臟病、卒中、下呼吸道感染和慢性阻塞性肺疾病仍然是導(dǎo)致人類死亡的四大主要原因[7]?；厮輦魅静“l(fā)展史，呼吸道感染病疫情從未間斷過，嚴(yán)重威脅著人類的健康，并造成嚴(yán)重的社會危害。高效快速地在病情早期對病原體進(jìn)行篩查和診斷，有利于盡早制定治療方案，緩解病痛，防止疫情擴(kuò)大，降低社會危害和國家醫(yī)療開支。隨著國內(nèi)體外診斷試劑的研發(fā)、技術(shù)和生產(chǎn)等方面的迅猛發(fā)展，國產(chǎn)診斷試劑由于其高速、高效、價格低廉等優(yōu)勢正在逐漸取代進(jìn)口產(chǎn)品。

制備抗原片，關(guān)鍵在于如何使病原體感染敏感細(xì)胞，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，傳代過夜的細(xì)胞處于活性最佳狀態(tài)，最適合病原體的感染。尤其是CP致病性較弱，我們運(yùn)用病原體感染Hep-2單層細(xì)胞并吸附1 h后，以2 600 r/min的轉(zhuǎn)速將病原體-細(xì)胞混合體進(jìn)行離心1 h，再繼續(xù)培養(yǎng)，感染效果有明顯提高，其機(jī)制還不十分明確，但推測可能是由于離心力使病原體和細(xì)胞被動接觸，借助重力加速度把病原體壓入細(xì)胞[8-9]，對于RSV、ADV、PIV致病性較強(qiáng)，吸附1-2 h后正常培養(yǎng)即可。總結(jié)幾種病原體感染敏感細(xì)胞的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)傳代次數(shù)較少的敏感細(xì)胞更利于病原體感染。

在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果時應(yīng)在熒光顯微鏡的熒光穩(wěn)定后，在1 h內(nèi)檢測完畢。經(jīng)后期實驗檢測，時間過長熒光強(qiáng)度將下降或淬滅。不僅如此，該檢測法受到主觀因素的影響。為此，疑似抗體陽性血清，應(yīng)做核酸檢測，以明確病毒感染的類型診斷[10]。

從上述試驗可以看出，運(yùn)用間接免疫熒光法新研發(fā)的試劑盒雖然特異性不如病毒培養(yǎng)法，但是克服了病毒培養(yǎng)法試驗周期長、不能同時檢測多種病原體的缺點(diǎn)，具有方便、靈敏、特異、高效、且一次可進(jìn)行多種病原體檢測等優(yōu)勢，對試驗開展環(huán)境和技術(shù)要求較低，在檢測的靈敏性和特異性方面與進(jìn)口產(chǎn)品沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的差別，并且醫(yī)療成本較低，適合在各級實驗室開展，為呼吸道感染性疾病的及時臨床診治提供可靠依據(jù)。但在實驗室檢測中，應(yīng)重視分析前、分析中和分析后的質(zhì)量控制，規(guī)范操作，注重細(xì)節(jié)，才能保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。